腫瘤可溶性抗原聯(lián)合超抗原致敏的DC誘導(dǎo)CIK對鼻咽癌細胞殺傷作用的研究

李付貴，陳　京，李曉玲，方慧云，季明芳，程偉民*

(1.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州510060；2.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤研究所，廣東 中山528400)

腫瘤可溶性抗原聯(lián)合超抗原致敏的DC誘導(dǎo)CIK對鼻咽癌細胞殺傷作用的研究

李付貴1，2，陳京2，李曉玲2，方慧云2，季明芳2，程偉民2*

(1.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州510060；2.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤研究所，廣東 中山528400)

摘要：目的探討腫瘤可溶性抗原聯(lián)合超抗原致敏的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)誘導(dǎo)細胞因子激活的殺傷細胞(cytokine-induced kill cells,CIK)對鼻咽癌細胞CNE-1的體外殺傷作用。方法分離人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，采用GM-CSF、IL-4和TNF-α體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，采用CD3Ab、IFN-γ、IL-2、IL-1等細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細胞。鼻咽癌腫瘤可溶性抗原(tumor soluble antigen,TSA)聯(lián)合超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素C(staphylococcal enterotoxin C,SEC)致敏DC；將未負載抗原的DC、單純負載鼻咽癌抗原TSA的DC、單純負載超抗原SEC的DC及負載TSA和SEC的DC分別與CIK細胞共同孵育，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的細胞毒性T細胞(cyctotoxic T lymphocyte,CTL)(各組效應(yīng)細胞分別簡稱為DC-CIK、TSA-DC-CIK、SEC-DC-CIK、TSA-SEC-DC-CIK)；采用CCK-8法檢測各效應(yīng)細胞對靶細胞CNE-1的殺傷作用。結(jié)果成功培養(yǎng)出高表達HLA-DR、CD1a、CD80的DC；效靶比為50∶1時，TSA-SEC-DC-CIK對靶細胞CNE-1的殺傷率為85.46±2.12%，明顯高于DC-CIK(51.36±0.61%)、TSA-DC-CIK(63.15±2.25%)及SEC-DC-CIK(65.32±3.24%)。結(jié)論腫瘤可溶性抗原聯(lián)合超抗原致敏的DC誘導(dǎo)CIK對鼻咽癌細胞有高效特異殺傷作用。

關(guān)鍵詞：樹突狀細胞；超抗原；金黃色葡萄球菌腸毒素C；鼻咽癌

(ChinJLabDiagn,2015,19:1987)

鼻咽癌是我國南方地區(qū)和東南亞國家常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率達10-50/10萬[1]。由于鼻咽癌發(fā)病部位比較隱匿，多數(shù)患者確診時已是晚期，常伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同期放化療為晚期鼻咽癌患者的標準治療模式，但患者5年生存率僅為50%-70%。局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因[2-5]。研究證實，在放化療后，以樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)為基礎(chǔ)的細胞免疫治療可以增強免疫系統(tǒng)的功能，加強抗腫瘤能力，抑制腫瘤生長[6]。本研究采用鼻咽癌腫瘤可溶性抗原(tumor soluble antigen,TSA)聯(lián)合超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素C(staphylococcal enterotoxin C,SEC)致敏DC誘導(dǎo)CIK產(chǎn)生特異性的細胞毒性T細胞(cyctotoxic T lymphocyte,CTL)，并探討其對鼻咽癌細胞的體外殺傷作用，為細胞免疫治療應(yīng)用于鼻咽癌治療提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料人鼻咽癌細胞株CNE-1(香港大學(xué)提供)。GT-T551無血清培養(yǎng)基(TaKaRa公司)，H-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，CD3單抗(RD公司)，GM-CSF、IL-1、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4(美國PEPRO TECH公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)，cell counting-cit8(CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所)，鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE、CD14-FITC、CD1a-PE、HLA-DR-FITC、CD80-PE(美國Beckman公司)，超抗原SEC(沈陽協(xié)和生物制藥股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1鼻咽癌細胞培養(yǎng)從液氮中取出人鼻咽癌細胞株CNE-1復(fù)蘇，以一定密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，采用含10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)液作為完全培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。每2-3天換液1次，待細胞達80%融合時，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2鼻咽癌可溶性抗原制備將培養(yǎng)3天左右處于對數(shù)生長期的CNE-1細胞用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，無菌生理鹽水洗滌3次，制備成濃度為1×107-1×108/ml細胞懸液，封裝入凍存管。然后置-80℃冰凍2 h，取出立即于37℃水浴30 min，如此反復(fù)凍融4次，5 000 r/min，離心40 min，收集上清即為TSA。檢測TSA蛋白含量，0.22 μm濾膜過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3DC的培養(yǎng)與鑒定取健康供者抗凝外周血50 ml，用密度為1.077 g/L的淋巴細胞分離液2 000 r/min離心15 min，收集白膜層，生理鹽水漂洗2次，以含10%FBS的GT-T551無血清培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)液，一定密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，去除非貼壁細胞，加入終濃度為1 000 U/ml的GM-CSF、500 U/ml的IL-4及含10%FBS的GT-T551無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增，第三天換液補充細胞因子，第5天加入終濃度為50 μg/ml的TSA及10 ng/ml的SEC，第6天加入終濃度為1 000 U/ml的TNF-α，第7天收集DC細胞。光學(xué)顯微鏡觀察DC細胞形態(tài)。流式檢測DC表型。

1.2.4CIK的培養(yǎng)與鑒定收集上一步驟中的未貼壁細胞，一定密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為40 ng/ml的CD3單抗、300 U/ml的IL-2、1 000 U/ml 的IFN-γ、500 U/ml的IL-1及含10%自體血漿的GT-T551無血清培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)擴增。光學(xué)顯微鏡觀察CIK細胞形態(tài)。流式檢測細胞表型。

1.2.5DC和CIK混合培養(yǎng)將負載TSA和SEC的DC設(shè)為實驗組，同時設(shè)單純負載TSA的TSA-DC對照組、單純負載SEC的SEC-DC對照組和未負載抗原的DC對照組。收集培養(yǎng)7天的四組DC細胞分別與培養(yǎng)7天的CIK細胞按1∶10的比例混合培養(yǎng)，誘導(dǎo)CTL細胞產(chǎn)生。各組效應(yīng)細胞分別簡稱為DC-CIK、TSA-DC-CIK、SEC-DC-CIK、TSA-SEC-DC-CIK。光學(xué)顯微鏡觀察各組效應(yīng)細胞形態(tài)。流式檢測效應(yīng)細胞表型。

1.2.6細胞殺傷試驗以混合培養(yǎng)7天的各組效應(yīng)細胞，分別作用于靶細胞CNE-1，效靶比分別按10∶1、20∶1和50∶1共同培養(yǎng)，24 h后光鏡觀察效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷效果，CCK-8法測定實驗孔和對照孔450 nm處光密度(oplical Density,OD)值并計算殺傷率。殺傷率=[1-(實驗組OD 值-效應(yīng)細胞組OD值)/靶細胞組OD值]×100%。

2結(jié)果

2.1細胞形態(tài)觀察從外周血采集的PBMC培養(yǎng)3h后，光鏡可見貼壁細胞多為體積較小的單個圓形細胞。經(jīng)細胞因子GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)24h后，可見部分細胞體積增大，懸浮于培養(yǎng)基中；第4天，可見細胞聚集成團，形態(tài)不規(guī)則。于培養(yǎng)第5天負載TSA和SEC，第6天加入TNF-α誘導(dǎo)成熟后，大部分細胞表面出現(xiàn)樹突狀突起，呈典型DC形態(tài)。未貼壁細胞經(jīng)CD3單抗、IL-2、IFN-γ、IL-1誘導(dǎo)3d后，光鏡可見細胞增殖迅速，大多聚集成細胞團。

2.2細胞表型鑒定DC經(jīng)流式鑒定，結(jié)果顯示高表達HLA-DR(99.9%)、CD1a(70.2%)、CD80(97.9%)，低表達CD14(0.2%)(圖1)。CIK細胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，高表達CD3+CD56+(29.3%)(圖2)。DC和CIK混合培養(yǎng)7天后，流式檢測各組CTL細胞表型，發(fā)現(xiàn)TSA-SEC-DC-CIK組CD3+CD8+T細胞百分比最高(表1)(P<0.05)。

圖1　DC細胞高表達CD1a、HLA-DR、CD80，低表達CD14

圖2　CIK細胞表型

2.3細胞殺傷試驗采用CCK-8法檢測細胞殺傷率，結(jié)果見表2。由表可看出，在同一效靶比時，TSA-SEC-DC-CIK組對靶細胞CNE-1的殺傷率明顯高于DC-CIK組(P<0.05)、TSA-DC-CIK組(P<0.05)及SEC-DC-CIK組(P<0.05)，這說明經(jīng)鼻咽癌TSA及超抗原SEC聯(lián)合刺激的DC-CIK具有高效而特異性的殺傷作用；各組細胞對靶細胞的殺傷率隨著效靶比提高而增強(P<0.05)。

表1　各組CTL細胞表型比較

注：*TSA-SEC-DC-CIK組與其余各組相比，P<0.05。

表2　效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率比較±s)

注：*TSA-SEC-DC-CIK組與其余各組相比，P<0.05。#效靶比20∶1與效靶比10∶1相比，P<0.05?！餍О斜?0∶1與效靶比20∶1相比，P<0.05

3討論

DC是功能最強的抗原提呈細胞，DC可以捕獲、加工抗原，遷移到淋巴器官中激活T細胞，尤其是初始T細胞(na?ve T cells)和靜息T細胞(resting T cells)。T細胞介導(dǎo)的細胞免疫特別是CTL在機體抗腫瘤和抗感染中發(fā)揮重要作用[7]，利用負載相關(guān)抗原的DC作為疫苗進行腫瘤生物治療大有前景[8]。

金黃色葡萄球菌腸毒素C是一種外源性超抗原，具有高效刺激T細胞增殖、增強免疫功能等生物學(xué)活性，它必須先與APC或靶細胞表面的MHC-II類分子抗原結(jié)合槽結(jié)合為復(fù)合體，才能被TCR識別出來提呈給T細胞，使T細胞激活，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。超抗原發(fā)揮作用主要表現(xiàn)在以下3個方面。(1)直接激活細胞毒性T細胞，使之殺傷靶細胞(2)被激活的T細胞分泌多種細胞因子，直接或間接殺傷靶細胞(3)借超抗原依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性殺傷靶細胞[9-12]。KatoM[13]研究發(fā)現(xiàn)DC聯(lián)合超抗原能顯著提高抗腫瘤免疫。將小鼠骨髓來源DC與腫瘤相關(guān)抗原OVA257-264及金葡菌腸毒素SEA、SEB共處理后接種給C57B L/6小鼠，結(jié)果顯示經(jīng)過超抗原及腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合致敏修飾的DC疫苗能顯著提高CD8+T細胞發(fā)揮OVA257-264特異的細胞殺傷活性及IFN-γ的產(chǎn)生，誘導(dǎo)針對EG7(T淋巴細胞瘤細胞)的抗腫瘤免疫。張慶波[14]等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤可溶性抗原與超抗原SEC聯(lián)合應(yīng)用能誘導(dǎo)效應(yīng)細胞明顯增殖、活化，產(chǎn)生高效特異抗腫瘤效果。Yu J[15]采用脂質(zhì)體將金葡菌腸毒素SEA基因轉(zhuǎn)染至小鼠黑色素瘤細胞B16，在合成宿主體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生SEA TDLN，與來自母本的野生型TDLN作對照。結(jié)果顯示，與野生型TDLN細胞相比，采用CD3、CD28及IL-2激活后，SEA TDLN細胞增殖更旺盛，產(chǎn)生更多的IFN-γ，激活更強的CTL反應(yīng)。此外，DC聯(lián)合腫瘤抗原及CD3、CD28、IL-2共刺激能提高SEA TDLN細胞的免疫功能及治療效果。DC刺激的SEA TDLN細胞能清除B16黑色素瘤小鼠90%的肺轉(zhuǎn)移。

本實驗從健康供者外周血中分離得到PBMC，在細胞因子GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)下，得到大量DC，在相差顯微鏡下呈現(xiàn)典型DC形態(tài)，在培養(yǎng)第5天，流式鑒定顯示DC高表達未成熟DC細胞表面標志物CD1a，在培養(yǎng)第6天加入TNF-α誘導(dǎo)DC成熟后，在培養(yǎng)第7天收集細胞進行流式鑒定顯示DC高表達MHCⅡ類分子HLA-DR、成熟DC表面標志共刺激分子CD80，低表達單核細胞表面標志CD14。Yang HX[16]研究發(fā)現(xiàn)負載抗原的DC正是通過DC表面MHCⅡ類分子和共刺激分子將抗原信息呈遞給T細胞以產(chǎn)生特異性的抗瘤效應(yīng)。我們將負載鼻咽癌TSA和超抗原SEC的DC設(shè)為實驗組，同時設(shè)單純負載TSA的TSA-DC對照組、單純負載SEC的SEC-DC對照組和未負載抗原的DC對照組。收集培養(yǎng)7天的四組DC細胞分別與培養(yǎng)7天的CIK細胞按1∶10的比例混合培養(yǎng)，誘導(dǎo)CTL細胞產(chǎn)生?；旌吓囵B(yǎng)7天后，研究顯示TSA-SEC-DC-CIK組CD8+T細胞百分比最高。將四組效應(yīng)細胞分別與靶細胞CNE-1共培養(yǎng)進行細胞殺傷實驗，結(jié)果顯示TSA-SEC-DC-CIK對靶細胞CNE-1的殺傷率明顯高于DC-CIK、TSA-DC-CIK及SEC-DC-CIK。由此可見，經(jīng)鼻咽癌TSA及超抗原SEC聯(lián)合致敏DC具有更強大的激活CTL能力，產(chǎn)生更高效特異的抗腫瘤效應(yīng)。

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Effect of cytokine-induced killer cells induced by dendritic cells pulsed with tumor soluble antigen and superantigen on cytotoxicity against nasopharyngeal carcinoma cellLIFu-gui,CHENJing,LIXiao-ling,etal.(CancerResearchInstitution,ZhongshanAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan528400,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the killing effect of dendritic cells (DCs) allergized by tumor soluble antigen and superantigen combining with cytokine-induced killer (CIK) cells on human nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE-1 in vitro.MethodsPBMCs were isolated from healthy donors and DCs were induced and cultured by GM-CSF,IL-4 and TNF-α,CIK cells were induced by CD3Ab,IFN-γ,IL-2,IL-1.DCs modified by nasopharyngeal carcinoma tumor soluble antigen (TSA) and staphylococcal enterotoxin C (SEC)；DCs modified by nothing or DCs modified by TSA or DCs modified by SEC or DCs modified by TSA and SEC were cultivated together with CIK cells,and the obtained cells were named DC-CIK or TSA-DC-CIK or SEC-DC-CIK or TSA-SEC-DC-CIK as effector cells.The anti-tumor activity of every effector cells against target cells was assayed with CCK-8 method.ResultsInduced DCs expressed more CD1a,CD80 and HLA-DR.When the E:T is 50∶1,the killing ratio of the TSA-SEC-DC-CIK in vitro to CNE-1 is 85.46±2.12%,which is higher than DC-CIK(51.36±0.61%),TSA-DC-CIK(63.15±2.25%) and SEC-DC-CIK(65.32±3.24%).ConclusionDCs allergized by tumor soluble antigen and superantigen can induce specific CIK cells which can significantly enhance antitumor effect on nasopharyngealcarcinoma cell.

Key words:Dendritic cell;Superantigen;Staphylococcal enterotoxin C;nasopharyngeal carcinoma

(收稿日期：2015-09-14)

作者簡介：李付貴，男，31歲，博士，主管技師，研究方向：干細胞分化機理和腫瘤防治機理。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R739.6

文章編號：1007-4287(2015)12-1987-05

*通訊作者

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金博士啟動基金(2014A030310013)；中國博士后基金(2014M562244)；中山市科技計劃項目(編號：2014A1FC048)