補(bǔ)陽還五湯對(duì)腦出血大鼠腦內(nèi)整合素α1β1和α1亞基表達(dá)的影響

楊阿莉，吳 季，崔寒盡，唐 濤，楊期東

腦出血具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn)，是卒中的主要類型。該病占全部腦卒中的10%～20%［1］，而在一些東方國家，該比例更高達(dá)30%～50%［2，3］。在中國，隨著人口的增長及經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，腦出血對(duì)于患者的家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。

血溢脈外形成血腫，對(duì)組織的直接破壞、占位效應(yīng)和周圍組織繼發(fā)性缺血是腦出血神經(jīng)功能缺損的主要原因，而氣虛血瘀是腦出血后各種生理病理變化的重要機(jī)制之一，因而益氣活血是中醫(yī)治療腦出血的重要治法。課題組既往研究證實(shí)腦出血后損傷區(qū)通過血管新生重建微血管系統(tǒng)［4］。整合素(Integrins)是細(xì)胞表面的一族跨膜糖蛋白，它通過介導(dǎo)細(xì)胞間、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)間的黏附和信號(hào)傳導(dǎo)從而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為，在血管新生過程中發(fā)揮重要的作用［5］。本實(shí)驗(yàn)選用中醫(yī)益氣活血的代表方補(bǔ)陽還五湯干預(yù)，采用免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡方法，以了解益氣活血中藥對(duì)腦出血后損傷區(qū)整合素α1β1和α1亞基表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 第一部分:Sprague-Dawley(SD)大鼠150 只，雌雄各半，7～9 周齡，體重220～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［許可證號(hào):SCXK(湘)2009-0004］，飼養(yǎng)于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、益氣組、活血組及益氣活血(補(bǔ)陽還五湯)組，每組30 只，5 組分別于造模灌胃3、7、14、21、28 d 后隨機(jī)抽取6 只大鼠處死。第二部分:SD 大鼠18 只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、益氣活血組，于造模灌胃14 d 后處死，余同第一部分。

1.2 中藥制備 所有生藥均一次性購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中藥房，按以下比例制備中藥浸膏。益氣活血組:補(bǔ)陽還五湯全方(黃芪、當(dāng)歸、赤芍、紅花、川芎、地龍、桃仁按20∶3∶3∶3∶2∶3∶3 比例);益氣組:補(bǔ)陽還五湯益氣組分(黃芪);活血組:補(bǔ)陽還五湯活血組分(當(dāng)歸、赤芍、紅花、川芎、地龍、桃仁按3∶3∶3∶2∶3∶3 比例)。浸膏分別配成0.44，0.225，0.215 g/ml 的溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腦出血模型制備 采用腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，取俯臥位固定于鼠腦立體定位儀(StoelTing TL-2 美國)，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行蒼白球定位:前囟后1.4 mm，旁開3.2 mm，深5.6 mm，微量注射器垂直進(jìn)針，注入100 μl取自股動(dòng)脈的新鮮自體動(dòng)脈血，假手術(shù)組大鼠僅注入100 μl 生理鹽水［6］。

1.4 動(dòng)物給藥及處理 大鼠術(shù)后蘇醒當(dāng)日即予灌胃。益氣活血組、益氣組、活血組每日分別予補(bǔ)陽還五湯全方、補(bǔ)陽還五湯益氣組分、補(bǔ)陽還五湯活血組分4.4，2.25，2.15 g/kg(按體表面積計(jì)算為臨床體重70 kg 成人劑量的3 倍)灌胃，2 次/d，2 ml/次。模型組和假手術(shù)組灌服蒸餾水2 次/d，2 ml/次。第一部分:各組大鼠分別灌胃3，7，14，21，28 d后予10%水合氯醛麻醉，以4 ℃的多聚甲醛心臟灌注固定，取腦，浸入多聚甲醛繼續(xù)固定4 h，蔗糖溶液脫水，低溫切片機(jī)(Shandon Cryotome E 英國)行30 μm冠狀切片，4 ℃PBS 中保存?zhèn)溆?。第二部?各組大鼠灌胃后14 d 予10%水合氯醛麻醉，4 ℃生理鹽水心臟灌注，取腦并分離右側(cè)腦組織，將以蒼白球(血腫)為中心的基底節(jié)部分置于凍存管中，浸入液氮后，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫組織化學(xué) 切片室溫復(fù)溫，3% H2O2孵化30 min 去除內(nèi)源性過氧化酶，5%牛血清白蛋白(BSA)37 ℃封閉60 min，滴加整合素α1β1單克隆抗體(美國Novus 公司)(1∶100)和整合素α1單克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)(1∶200)，37 ℃孵育60 min，4 ℃過夜，滴加二抗(1∶200)和ABC 復(fù)合物(北京中杉)(1∶100)，37 ℃孵育各60 min，DAB(北京中杉)鏡下控制顯色。脫水透明中性樹脂封片。以上步驟除封閉后不洗外，各步驟之間用PBS 洗5 min×3 次。用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.6 蛋白免疫印跡 組織從－80 ℃冰箱中取出后，加入RIPA 裂解液勻漿數(shù)次后置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12000 g/min 離心30 min，取上清。BCA 法測定蛋白含量，配制8%分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃電轉(zhuǎn)移，封閉后加一抗(美國Novus 公司，美國Santa Cruz 公司)(1∶400)4 ℃孵育過夜，予TBST 漂洗后，加二抗(北京中杉)(1∶5000)室溫孵育1 h。TBST 漂洗后，置于BIO-RAD凝膠成像儀中加入ECL 發(fā)光液檢測蛋白條帶。

1.7 圖像分析 免疫組織化學(xué)法:免疫組化反應(yīng)陽性結(jié)果為血腫周邊血管內(nèi)皮棕染。采用Motic Image Advanced 3.2 圖像分析軟件，每只大鼠隨機(jī)選擇4 張片，在光鏡下(×200)，每張切片隨機(jī)選擇3 個(gè)視野進(jìn)行分析，測定其陽性面積(單位mm2)和平均光密度(optical density，OD)值，以二者乘積代表整合素α1β1和α1表達(dá)水平，計(jì)算其表達(dá)量。免疫蛋白印跡法:伯樂凝膠成像系統(tǒng)軟件分析各蛋白條帶光密度，每組光密度值應(yīng)與相應(yīng)內(nèi)參β-actin 相比較取比值后再進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦出血后整合素α1β1和α1亞基在新生血管的時(shí)空表達(dá) 假手術(shù)組未見明顯陽性表達(dá)。各組3 d 時(shí)可在血腫周邊查見陽性血管;7 d時(shí)陽性血管靠近血腫，14～28 d 時(shí)陽性血管明顯增多，同時(shí)部分血管深入血腫區(qū)(見圖1)。

圖1 模型組大鼠腦出血14 d 后整合素α1β1(A)和α1(B)亞基的表達(dá)(DAB 染色，×200)

2.2 腦出血后大鼠血腫周圍新生血管整合素α1β1的表達(dá) 假手術(shù)組未見明顯陽性表達(dá)。模型組和各處理組新生血管內(nèi)皮整合素α1β1的表達(dá)趨勢(shì)大致相近。3 d 時(shí)即查見各組血腫周邊新生血管內(nèi)皮表達(dá)α1β1，各組表達(dá)無明顯差異。7 d 時(shí)各組表達(dá)均增高，與3 d 比較差異明顯(P＜0.05)。14 d時(shí)各組陽性微血管表達(dá)較7 d 繼續(xù)增高(P＜0.05)，達(dá)到高峰。21～28 d 時(shí)高峰表達(dá)持續(xù)，同14 d 無明顯差別(P＞0.05)。7～28 d 時(shí)益氣活血組表達(dá)高于同時(shí)點(diǎn)的其他三組(P＜0.05)(見圖2A)。

2.3 腦出血后大鼠血腫周圍新生血管內(nèi)皮整合素α1的表達(dá) 假手術(shù)組未見明顯陽性表達(dá)。模型組和各處理組新生血管內(nèi)皮整合素α1亞基表達(dá)趨勢(shì)大致相近。3 d 時(shí)即查見各組血腫周邊新生血管內(nèi)皮表達(dá)整合素α1亞基，各組表達(dá)無明顯差異。7 d 各組表達(dá)均增高，與3 d 比較差異明顯(P＜0.05)。14 d 時(shí)各組陽性微血管表達(dá)較7 d 繼續(xù)增高(P＜0.05)，達(dá)到高峰。21～28 d 高峰表達(dá)持續(xù)，同14 d 無明顯差別(P＞0.05)。7～28 d 時(shí)益氣活血組、14～21 d 活血組表達(dá)均高于同時(shí)點(diǎn)模型組(P＜0.05)，且益氣活血組在21、28 d 時(shí)高于同時(shí)點(diǎn)益氣組(P＜0.05)(見圖2B)。

2.4 腦出血后大鼠血腫周圍整合素α1蛋白表達(dá) 腦出血后14 d α1亞基蛋白表達(dá)增強(qiáng)，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后，α1亞基蛋白表達(dá)水平高于腦出血模型組(P＜0.05)(見圖3)。

圖2 腦出血大鼠血腫周邊血管整合素α1β1(A)和α1(B)的表達(dá)

圖3 腦出血后14 d 大鼠血腫周邊整合素α1亞基的表達(dá)

3 討論

血管新生是腦卒中后損傷區(qū)腦組織功能恢復(fù)的重要過程，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。在此過程中，除血管內(nèi)皮細(xì)胞自身增殖外，新生血管與ECM 之間的相互作用也非常重要。ECM 作為細(xì)胞黏附的基質(zhì)，在血管新生的過程中起到傳導(dǎo)信號(hào)、調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞(endoththelial cells，ECs)生物學(xué)行為的作用。整合素作為ECM 的主要受體，介導(dǎo)了新生血管和ECM 的基本相互作用［7］。

目前發(fā)現(xiàn)的整合素家族中，整合素α1亞基僅參與構(gòu)成整合素α1β1，且本研究第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血腫周圍新生血管整合素α1亞基表達(dá)趨勢(shì)與整合素α1β1基本一致，且整合素是由α 亞基及β 亞基組成的異二聚體，在蛋白免疫印跡法處理過程中會(huì)分離，故兩部分實(shí)驗(yàn)中整合素α1亞基的表達(dá)均可認(rèn)作是對(duì)整合素α1β1的驗(yàn)證。

整合素α1β1的配體為層粘連蛋白(laminin，Ln)。除了Ln，整合素α1β1還可以與膠原IV 特異性粘附。在血管新生過程中，α 亞基表達(dá)早期以α4和α5為主，后期則轉(zhuǎn)變?yōu)棣?和α6，同時(shí)其配體亦由纖連蛋白(fibrinogen，F(xiàn)n)轉(zhuǎn)變?yōu)長n。故整合素α1β1主要作用于血管新生中后期以維持新生血管的穩(wěn)定和完整性。另有研究證實(shí)，整合素α1β1通過生長因子介導(dǎo)ERK 信號(hào)通路可保護(hù)ECs 免于凋亡并增強(qiáng)ECs 增殖［8，9］。在整合素α1亞基敲除的動(dòng)物中有過量的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-7、MMP-9、MMP-12 表達(dá)［10］，可將循環(huán)型纖溶酶原降解為血管抑素，進(jìn)而抑制血管新生［11，12］。

腦出血后14 d 血管新生達(dá)到高峰［13］，本研究也顯示腦出血后14～28 d 整合素陽性血管增多。既往有研究顯示腦出血后7 d TNF-α 仍可刺激整合素α1β1過表達(dá)，所以腦出血7 d 時(shí)整合素α1β1和α1亞基表達(dá)較3 d 有所增高，而整合素α1β1主要作用在血管新生的中后期維持血管完整性，故在14 d時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰并持續(xù)到28 d。整合素α1β1除了與配體Ln 結(jié)合外還可與膠原IV 特異性粘附，本課題組其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)膠原在血管新生的初始、侵入階段都有表達(dá)［14］。腦出血后整合素α1β1表達(dá)上調(diào)的上游因素可能有:(1)各種生長因子表達(dá)上調(diào):整合素α1β1可通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-A/VEGFR-2 機(jī)制上調(diào)表達(dá)［15］，VEGF 可以激活并增加整合素α1β1表達(dá)從而促進(jìn)血管新生［16］。腦出血后腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α 表達(dá)增加［17］，研究證實(shí)TNF-α 的增加與整合素α1β1表達(dá)增高有因果關(guān)系［18］。(2)炎癥反應(yīng):整合素α1β1可在激活的記憶T 細(xì)胞作用下表達(dá)，并參與炎癥應(yīng)答［19］。

腦出血屬中醫(yī)“中風(fēng)”“卒中”“薄厥”范疇，氣虛血瘀是出血性卒中后病理生理變化的重要機(jī)制之一，補(bǔ)陽還五湯是清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中為益氣活血法所創(chuàng)代表方，中醫(yī)運(yùn)用補(bǔ)陽還五湯在臨床上治療腦出血患者療效確切，且臨床實(shí)驗(yàn)中本法可有效縮小血腫及水腫面積［20～22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)益氣活血法中的活血組分和補(bǔ)陽還五湯全方組處理后整合素α1β1和α1亞基在多個(gè)時(shí)點(diǎn)表達(dá)較模型組均明顯上調(diào)，且以益氣活血組更明顯，提示補(bǔ)陽還五湯全方中益氣組分和活血組分二者協(xié)同作用是臨床療效的基石。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果也顯示:腦出血后整合素α1亞基蛋白表達(dá)水平增加，而益氣活血組α1亞基表達(dá)明顯高于模型組，可見補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)加強(qiáng)了整合素α1β1對(duì)腦出血后血管新生的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而促進(jìn)損傷腦組織功能恢復(fù)。中醫(yī)藥干預(yù)能在腦出血急性期改變血液流變學(xué)，減輕腦水腫和炎性反應(yīng)，減少凝血酶、炎癥因子的釋放，減少細(xì)胞凋亡［23］，部分可刺激整合素α1β1表達(dá)的因子(如TNF-α 等)會(huì)在處理組干預(yù)后減少，但處理組整合素α1β1的表達(dá)仍繼續(xù)增高，可能由于藥物干預(yù)刺激VEGF 表達(dá)較模型組升高［24］，而VEGF 是整合素α1β1促血管生成的主要刺激因子。

綜上所述，本研究提示補(bǔ)陽還五湯可通過調(diào)節(jié)腦出血后新生血管整合素α1β1和α1的表達(dá)，參與維持新生血管的穩(wěn)定，促進(jìn)損傷區(qū)微血管系統(tǒng)重建，實(shí)現(xiàn)其益氣活血的作用，從而修復(fù)損傷組織。這可能是益氣活血中藥治療腦出血的重要機(jī)制之一，也將為腦出血后的聯(lián)合治療提供新的思路。

［1］Ikram MA，Wieberdink RG，Koudstaal PJ.International epidemiology of intracerebral hemorrhage［J］.Curr Atheroscler Rep，2012，14(4):300-306.

［2］Dennis MS.Outcome after brain haemorrhage［J］.Cerebrovasc Dis，2003，16(Suppl):9-13.

［3］王文志.中國腦卒中流行病學(xué)特征和社區(qū)人群干預(yù)［J］.中國醫(yī)學(xué)前沿雜志，2009，1(2):49-53.

［4］Tang T，Liu XJ，Zhang ZQ，et al.Cerebral angiogenesis after collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Brain Res，2007，1175:134-142.

［5］Hodivala-Dilke KM，Reynolds AR，Reynolds LE.Integrins in angiogenesis:multitalented molecules in a balancing act［J］.Cell Tissue Res，2003，314(1):131-144.

［6］Maclellan CL，Silasi G，Poon CC，et al.Intracerebral hemorrhage models in rat:comparing collagenase to blood infusion［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2008，28(3):516-525.

［7］Rhodes JM，Simons M.The extracellular matrix and blood vessel formation:not just a scaffold［J］.J Cell Mol Med，2007，11(2):176-205.

［8］Perruzzi CA，de Fougerolles AR，Koteliansky VE，et al.Functional overlap and cooperativity among alphav and beta1 integrin subfamilies during skin angiogenesis［J］.J Invest Dermatol，2003，120(6):1100-1109.

［9］Senger DR，Perruzzi CA，Streit M，et al.The alpha(1)beta(1)and alpha(2)beta(1)integrins provide critical support for vascular endo-thelial growth factor signaling，endothelial cell migration，and tumor angiogenesis［J］.Am J Pathol，2002，160(1):195-204.

［10］Steffgen K，Dufraux K，Hathaway H.Enhanced branching morphogenesis in mammary glands of mice lacking cell surface beta1，4-galactosyltransferase［J］.Dev Biol，2002，244(1):114-133.

［11］Patterson BC，Sang QA.Angiostatin-converting enzyme activities of human matrilysin(MMP-7)and gelatinase B/type IV collagenase(MMP-9)［J］.J Biol Chem，1997，272(46):28823-28825.

［12］Dong Z，Kumar R，Yang X，et al.Macrophage-derived metalloelastase is responsible for the generation of angiostatin in Lewis lung carcinoma［J］.Cell，1997，88(6):801-810.

［13］Zhou HJ，Zhang HN，Tang T，et al.Alteration of thrombospondin-1 and-2 in rat brains following experimental intracerebral hemorrhage.Laboratory investigation［J］.J Neurosurg，2010，113(4):820-825.

［14］羅 娟，唐 濤，吳 季，等.益氣活血法對(duì)腦出血大鼠腦組織Ⅳ型膠原表達(dá)的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，31(15):2882-2884.

［15］Ramjaun AR，Hodivala-Dilke K.The role of cell adhesion pathways in angiogenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41(3):521-530.

［16］Lee TH，Seng S，Li H，et al.Integrin regulation by vascular endothelial growth factor in human brain microvascular endothelial cells:role of alpha6beta1 integrin in angiogenesis［J］.J Biol Chem，2006，281(52):40450-40460.

［17］Wang J，Dore S.Inflammation after intracerebral hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(5):894-908.

［18］Ding YH，Li J，Yao WX，et al.Exercise preconditioning upregulates cerebral integrins and enhances cerebrovascular integrity in ischemic rats［J］.Acta Neuropathol，2006，112(1):74-84.

［19］Baker KA，Hagg T.Developmental and injury-induced expression of alpha1beta1 and alpha6beta1 integrins in the rat spinal cord［J］.Brain Res，2007，1130(1):54-66.

［20］孫振山.補(bǔ)陽還五湯加減治療急性期中小量腦出血30 例［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(2):49-50.

［21］孫 皓，郭富強(qiáng)，王多姿，等.補(bǔ)陽還五湯化裁對(duì)大鼠腦出血后腦水腫的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(12):22-23.

［22］尹浩軍，魏發(fā)善.補(bǔ)陽還五湯加減治療高血壓性腦出血的臨床觀察［J］.湖北中醫(yī)雜志，2014，36(6):1-2.

［23］秦 峰，王長松，晉光榮，等.犀角地黃湯對(duì)大鼠腦出血急性期Bcl-2，caspase-3，TNF-α，IL-6 表達(dá)的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34(12):1566-1569.

［24］劉小娟，唐 濤，羅杰坤，等.補(bǔ)陽還五湯對(duì)腦出血大鼠腦內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子mRNA 表達(dá)的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(2):100-103.