腦紅蛋白在腦梗死大鼠表達(dá)及丁苯酞干預(yù)效應(yīng)

閆瑩瑩，婁季宇，白宏英，楊霄鵬，焦義明，樂 婷，劉海燕

腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是Burmester 等［1］發(fā)現(xiàn)的主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的第三類攜氧珠蛋白，與氧有很高的親和力，促進(jìn)氧傳遞到線粒體，提高腦組織氧利用率。NGB 減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ROS/RNS 過表達(dá)和脂質(zhì)過氧化作用，抑制線粒體功能障礙、凋亡及細(xì)胞死亡［2］。降低NGB 表達(dá)會增加組織和細(xì)胞缺氧損傷程度，缺血/缺氧可啟動NGB 對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)，從而為治療腦卒中的候選藥物。丁苯酞(NBP)具有明確抗腦缺血作用，但其具體的機(jī)制未完全明了。本文旨在研究NBP 是否調(diào)節(jié)腦缺血大鼠NGB 表達(dá)，減少氧化應(yīng)激損傷，從而為NBP治療腦梗死患者提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康雄性SD 大鼠90只，體重280g～350 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號SCXK(豫)2010-0002)。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組。每組按術(shù)后處死時(shí)間分為3 個(gè)亞組:1 d、3 d 和7 d，每亞組10 只。

1.2 藥物和主要試劑 NBP 原料藥由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供，批號518120502。以植物油制成濃度為32 mg/ml 溶劑用于動物灌胃。RT-PCR 試劑盒和Trizol 購自Transgen 公司，引物購自北京博大泰克公司;NGB 單克隆兔抗鼠抗體購自美國Sigma 公司;SOD、MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。圖像采集使用德國Lecia 顯微照像系統(tǒng)，圖像分析系統(tǒng)為上海山富科學(xué)儀器有限公司(Biosens Digital Imaging System v1.6)。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 治療組于術(shù)后2 h 按80 mg/kg 丁苯酞植物油灌胃，假手術(shù)組和模型組予等量植物油灌胃，每天2 次。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物模型建立 10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射(ip)麻醉，仰臥位固定，頸部備皮，消毒，頸部正中切口，鈍性分離各層組織，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA 遠(yuǎn)心端，動脈夾夾閉CCA 及ICA，剪斷ECA，沿ECA 殘端向ICA 插入魚線，進(jìn)入長度約18 mm±0.5 mm 時(shí)，可感阻力，停止插線，ECA 殘端結(jié)扎并固定魚線。清理切口，逐層縫合。術(shù)后60W 白熾燈直接照射保持肛溫37 ℃。假手術(shù)組只分離，不結(jié)扎，不插線。

采用Longa 等［3］制定的5 級神經(jīng)功能缺損評分法對腦梗死大鼠術(shù)后3 h 和各時(shí)間點(diǎn)處死前行行為學(xué)評分。1 分以上為模型制作成功，選擇評分在1～3 分大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，剔除神經(jīng)損傷太重或無損傷大鼠并予以補(bǔ)充。

1.3.3 標(biāo)本采集及保存 每組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，隨機(jī)取5 只心臟灌注4%多聚甲醛后取腦，4%多聚甲醛固定24 h 后石蠟包埋保存。其余5只斷頭新鮮取腦，液氮迅速冷凍后移于-80℃冰箱保存。

1.3.4 RT-PCR 檢測 NGB mRNA Trizol 一步法提取腦組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)定量，取少量用于RNA 含量及純度測定。總RNA 先用RNase H 處理后，用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行cDNA 的合成及PCR 反應(yīng)。通過大鼠NGB cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，如下:上游:5’-CCGCAGCCCTCTGGAACAT-3’;下游:5’-TGTAGAGCAGGGACTCACCTA-3’;擴(kuò)增產(chǎn)物長度296 bp。以GAPDH 為內(nèi)參照，引物序列為上游:5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’;下游:5’-TGATGGCATGGACTGTGG-3’;擴(kuò)增產(chǎn)物長度506 bp。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min，一個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸6 min。PCR 擴(kuò)增目的產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對目的條帶用凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，對目的條帶與內(nèi)參GAPDH 的DNA 條帶灰度值的比值進(jìn)行相對含量計(jì)算。

1.3.5 免疫組化法檢測NGB 表達(dá) 大鼠腦組織石蠟切片5 μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS洗3 次，高壓抗原修復(fù)5 min，自然冷卻，PBS 沖洗3次，用二抗同源血清進(jìn)行封閉，甩掉血清，滴加一抗50 μl，室溫下孵育1 h;滴加二抗50 μl 室溫孵育15 min，DBA 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明及封片。100 倍鏡下觀察，400 倍鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，同時(shí)采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.6 化學(xué)比色法檢測SOD 活性和MDA 含量 將新鮮腦組織用磷酸鹽漂洗3 次，除去血液、濾紙拭干，精確稱重后制備10%勻漿，3000 r/min 離心15 min，取上清液按測試盒說明書進(jìn)行SOD 活性和MDA 含量檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和處理，計(jì)量資料用 表示，多組間多時(shí)間點(diǎn)比較采用析因方差分析，進(jìn)一步分析分組單獨(dú)效應(yīng)，方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3 法，兩獨(dú)立樣本比較采用t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 除術(shù)后3 h 外，治療組神經(jīng)功能評分均低于模型組;不同時(shí)間點(diǎn)之間兩組神經(jīng)功能評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后3 h 評分開始增加，1 d 達(dá)峰，隨后逐漸下降;分組和時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(P＜0.05)(見表1)。

2.2 NGB mRNA 表達(dá) 不同組間NGB mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組較假手術(shù)組高，治療組較模型組高;不同時(shí)間點(diǎn)間NGB mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)NGB mRNA 差異不明顯，模型組和治療組NGB mRNA 表達(dá)隨時(shí)間延長逐漸降低;分組和時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(P＜0.05)(見表2、圖1)。

2.3 NGB 蛋白表達(dá) 不同組間NGB 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組較假手術(shù)組高，治療組較模型組高;不同時(shí)間點(diǎn)間NGB 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)NGB 差異不明顯，模型組和治療組NGB 表達(dá)隨時(shí)間延長逐漸下降;分組和時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(P＜0.05)(見表3)。

2.4 SOD 活性、MDA 含量檢測 不同組間SOD 活性和MDA 含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，SOD 活性模型組較假手術(shù)組低，治療組較模型組高、較假手術(shù)組低;MDA 含量模型組較假手術(shù)組高，治療組較模型組低、較假手術(shù)組高;不同時(shí)間點(diǎn)間SOD 活性和MDA 含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)SOD 活性和MDA 含量差異不明顯，模型組和治療組SOD 活性和MDA 含量表達(dá)均隨時(shí)間延長逐漸下降;分組和時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(P＜0.05)(見表4、表5)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)模型組和治療組神經(jīng)功能評分比較(±s)

表1 各時(shí)間點(diǎn)模型組和治療組神經(jīng)功能評分比較(±s)

分組主效應(yīng):F 組間=26.947，P=0.000;時(shí)間主效應(yīng):F 時(shí)間=19.579，P=0.000;交互效應(yīng):F 交互=4.842，P=0.006。#表示與模型組比較，P＜0.05

表2 各時(shí)間點(diǎn)3 組間NGB mRNA 表達(dá)比較(±s)

表2 各時(shí)間點(diǎn)3 組間NGB mRNA 表達(dá)比較(±s)

分組主效應(yīng):F 組間=1224.040，P=0.000;時(shí)間主效應(yīng):F 時(shí)間=252.000，P=0.000;交互效應(yīng):F 交互=64.980，P=0.000。* 表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

表3 各時(shí)間點(diǎn)3 組間NGB 平均光密度值比較(±s)

表3 各時(shí)間點(diǎn)3 組間NGB 平均光密度值比較(±s)

分組主效應(yīng):F 組間=173.903，P=0.000;時(shí)間主效應(yīng):F 時(shí)間=25.374，P=0.000;交互效應(yīng):F 交互=12.352，P=0.000。* 表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

表4 大鼠腦組織3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD 活性(U/mgpro)(±s)

表4 大鼠腦組織3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD 活性(U/mgpro)(±s)

分組主效應(yīng):F 組間=245.01，P=0.000;時(shí)間主效應(yīng):F 時(shí)間=20.059，P=0.000;交互效應(yīng):F 交互=9.405，P=0.000。* 表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

表5 大鼠腦組織3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)MDA 含量(mmol/mgpro)(±s)

表5 大鼠腦組織3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)MDA 含量(mmol/mgpro)(±s)

分組主效應(yīng):F 組間=448.833，P=0.000;時(shí)間主效應(yīng):F 時(shí)間=121.918，P=0.000;交互效應(yīng):F 交互=26.699，P=0.000。* 表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

3 討論

腦是機(jī)體代謝率最高的器官，缺血時(shí)造成細(xì)胞能量代謝紊亂，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，氧化應(yīng)激損傷，在腦缺血后神經(jīng)元損傷中起關(guān)鍵作用。如何改善腦梗死患者能量代謝和降低氧化應(yīng)激損傷，成為科研和臨床工作重點(diǎn)。NBP 是從芹菜種子中分離出的有效成分，又叫作芹菜甲素，可阻斷缺血性腦卒中所致?lián)p傷的多個(gè)病理環(huán)節(jié)，具有較強(qiáng)抗腦缺血作用。明顯縮小大鼠局部腦缺血梗死面積，減輕水腫，改善能量代謝和缺血區(qū)微循環(huán)和血流量，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，以及抗腦血栓形成和抗血小板聚集等藥理作用［4］。

NGB 是繼血紅蛋白和肌紅蛋白之后發(fā)現(xiàn)的攜氧珠蛋白，主要表達(dá)在脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜細(xì)胞中［5］。目前研究揭示了NGB 作為內(nèi)生性神經(jīng)保護(hù)因子，在腦梗死和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起作用，關(guān)于其機(jī)制進(jìn)行了很多研究。Li 等［6］離體研究證實(shí)NGB 通過PTEN-AKT 通路促進(jìn)軸突再生。Khan等［7］研究認(rèn)為NGB 通過抑制膜死亡傳導(dǎo)信號復(fù)合體形成來保護(hù)神經(jīng)元免受NMDA 和β 淀粉樣蛋白毒性作用。Li 等［8］認(rèn)為NGB 具有抗氧化特性，減少氧化應(yīng)激損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NGB 主要在神經(jīng)元表達(dá)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)，與既往研究結(jié)果相符。模型組較假手術(shù)組、治療組較模型組NGB 表達(dá)增高，提示腦缺血時(shí)機(jī)體啟動了內(nèi)生性保護(hù)因子，減少急性應(yīng)激損傷。而且丁苯酞可上調(diào)NGB 表達(dá)減少腦缺血損傷。試驗(yàn)中NGB 表達(dá)隨時(shí)間呈下降趨勢，提示其表達(dá)已于24h 內(nèi)達(dá)到高峰，即缺血引起NGB 上調(diào)已達(dá)最大程度。如果刺激持續(xù)存在，神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧亦進(jìn)一步加重并超出自身代償能力，NGB 表達(dá)降低，使細(xì)胞供氧進(jìn)一步下降，缺氧情況急劇惡化，細(xì)胞功能喪失并走向死亡。

在腦梗死病理生理中，氧化應(yīng)激占有重要地位。ROS 過量產(chǎn)生不僅引起脂質(zhì)、蛋白和DNA 等重要細(xì)胞成分氧化，也改變腦梗死中重要信號通路，最終引起細(xì)胞損傷和死亡［2］。腦缺血時(shí)細(xì)胞受自由基攻擊引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，形成大量脂質(zhì)過氧化物，其中以MDA 毒性最大，間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊嚴(yán)重程度。SOD 是機(jī)體清除氧自由基，阻斷自由基病理性連鎖反應(yīng)最重要的防御酶，其活性測定作為清除氧自由基能力主要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組較假手術(shù)組腦組織中MDA 含量顯著升高，SOD 活性顯著降低，表明腦缺血誘發(fā)了腦組織氧化應(yīng)激損傷。隨著時(shí)間變化，MDA 含量逐漸減少，SOD 活性逐漸升高，可能與ROS 作為機(jī)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)信號分子，上調(diào)SOD 表達(dá)，調(diào)控其自身水平有關(guān)［9］，啟動腦內(nèi)代償機(jī)制。治療組較模型組MDA 含量下降，SOD 活性升高。提示NBP 可提高腦梗死大鼠SOD 活性，降低MDA 含量。其可以對抗自由基，拮抗過氧化損傷，可能與抑制黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中超氧陰離子自由基形成有關(guān)。Burmester 等［10］認(rèn)為NGB 有提供氧氣和減少ROS 損傷作用，Watanabe 等［11］研究認(rèn)為NGB 通過抑制氧化應(yīng)激引起的cAMP 濃度下降，保護(hù)損傷細(xì)胞。NBP 可能也通過上調(diào)NGB 表達(dá)，間接減少氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮對缺血性神經(jīng)元保護(hù)作用。

綜上所述，NBP 對缺血大鼠腦損傷有保護(hù)作用，機(jī)制可能為上調(diào)缺血腦組織NGB 表達(dá)，提高SOD 活性，增加氧供，改善能量代謝，促進(jìn)自由基清除，對抗脂質(zhì)過氧化損傷，進(jìn)而降低MDA 含量，穩(wěn)定細(xì)胞膜，改善腦組織病理變化，提高神經(jīng)元對缺血缺氧耐受性。這可能為NBP 治療腦梗死提供一些理論依據(jù)。但NBP 如何上調(diào)MCAO 大鼠腦組織中NGB 表達(dá)，減少氧化應(yīng)激損傷需要體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步研究。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)不同組NGB mRNA 表達(dá)比較

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