索拉非尼對肝癌組織和癌旁肝組織中SDF1-α表達的影響

陸錄　朱文偉　陳進宏　賈戶亮

(復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科，上海　200040)

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·論著·

索拉非尼對肝癌組織和癌旁肝組織中SDF1-α表達的影響

陸錄朱文偉陳進宏賈戶亮

(復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科，上海200040)

摘要目的：從基質(zhì)細胞衍生因子1-α(stromal-derived factor 1-α，SDF 1-α)入手，研究索拉非尼致肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強的機制。方法： 用HCCLM3細胞株建立BALB/c裸鼠原位肝癌模型并分為索拉非尼組和對照組，每組6只。索拉非尼組建模后2周開始給予索拉非尼灌胃，劑量為30 mg/(kg·d)；對照組建模后2周用0.9%氯化鈉液灌胃；給藥4周后處死裸鼠。采用RT-PCR法檢測兩組裸鼠肝癌和癌旁肝組織中鼠源性炎性相關(guān)因子的mRNA表達；通過免疫組化染色檢測肝癌和癌旁肝組織中SDF1-α的表達；采用Western blotting檢測癌旁肝組織中SDF1-α的表達；采用ELISA法檢測外周血中SDF1-α的濃度。結(jié)果：索拉非尼治療可以使肝癌組織以及癌旁肝組織中鼠源性SDF1-α的mRNA表達增加。免疫組化及Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，索拉非尼可明顯上調(diào)肝癌及癌旁肝組織中SDF1-α的蛋白表達水平。ELISA結(jié)果顯示，索拉非尼可使外周血中鼠源性SDF1-α的濃度升高。結(jié)論：索拉非尼治療可明顯上調(diào)肝癌組織和癌旁肝組織中SDF1-α的表達。

關(guān)鍵詞肝細胞肝癌；索拉非尼；基質(zhì)細胞衍生因子1-α；侵襲轉(zhuǎn)移

基本項目：國家自然科學基金項目(編號：81101564;81472671)

肝細胞癌(簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一。目前，手術(shù)切除仍是治療肝癌最有效的方法，但患者在確診時大多已屬晚期，不適合手術(shù)治療[1]。索拉非尼(sora-fenib)是晚期肝癌患者的一線治療藥物[2]。然而，兩項針對索拉非尼的Ⅲ期臨床試驗[3-4]均發(fā)現(xiàn)，索拉非尼對晚期肝癌可顯著延長腫瘤進展時間和患者生存時間，但其延長的中位生存期不足3個月，療效不滿意。另有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，索拉非尼治療肝癌雖抑制了原發(fā)癌但卻同時促進了轉(zhuǎn)移癌的生長。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起非常重要的作用。基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)又稱為趨化因子配體12(CXCL12)，SDF1-α是其一種主要的亞型。SDF1-α由成纖維細胞、炎性細胞、內(nèi)皮細胞等基質(zhì)細胞分泌，通過與其受體CXCR4結(jié)合而促進腫瘤生長[8]。本研究通過檢測肝癌、癌旁組織中SDF1-α的表達水平，探討SDF1-α在索拉非尼引起的肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強中所起的作用。

1資料與方法

1.1實驗動物、細胞株及藥物雄性BALB/c裸鼠，6周齡，體質(zhì)量15~20 g，購自中國科學院上海藥物研究所，飼養(yǎng)于25℃恒溫的SPF級層流室，12 h光照和12 h黑暗交替，自由進食標準顆粒飼料及飲水。HCCLM3細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。索拉非尼購自德國拜耳醫(yī)藥公司。

1.2裸鼠原位肝癌模型的建立及給藥方式無菌條件下，在裸鼠皮下注射1×107個體外培養(yǎng)的 HCCLM3 細胞。待3~4周皮下成瘤后，在無菌條件下取瘤體，浸入預冷的0.9%氯化鈉液中，剪切為2 mm×1 mm×1 mm，備用。腹腔注射戊巴比妥(2.5 mg/kg)麻醉裸鼠，消毒手術(shù)野，以左肋緣下斜切口(長度約8 mm)進腹，將肝葉從切口取出，斜形切開肝表面，植入已備好的瘤塊，用6-0縫線縫合肝切緣，用5-0縫線雙層縫合腹壁和皮膚。術(shù)后2周開始給藥，將400 mg索拉非尼溶于100 mL的溶劑(蓖麻油∶乙醇∶dH2O=12.5∶12.5∶75)中，給裸鼠灌胃，劑量為30 mg/(kg·d)。給藥4周后處死裸鼠并取材。

1.3實驗方法

1.3.1實時熒光定量PCR檢測SDF1-αmRNA表達用TrIzol提取肝癌及癌旁肝組織的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程 (大連) 有限公司]的說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用寶生物工程 (大連) 有限公司的SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進行熒光定量PCR，檢測mRNA表達。PCR擴增條件為：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s；循環(huán)40次。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1　PCR引物序列

1.3.2Western blotting檢測SDF1-α蛋白表達用蛋白裂解液提取組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。Western blotting按常規(guī)方法進行，抗體為兔抗小鼠SDF1-α(1∶1000，英國Abcam公司)，采用ECL 化學發(fā)光法在瑞典Apharmacia Biotech公司生產(chǎn)的凝膠成像儀中曝光。

1.3.3免疫組織化學染色法檢測SDF1-α蛋白的表達取肝癌和癌旁肝組織，制作石蠟切片，按常規(guī)方法進行免疫組化染色。一抗為兔抗小鼠SDF1-α(1∶200，英國Abcam公司)，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶200，英國AbD Serotec公司)。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.3.4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿中SDF1-α蛋白的表達按ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司)說明書進行操作。用酶標儀(3550UV型，美國Bio-Rad公司)450/540nm雙波長檢測各樣品的吸光度(OD值)。根據(jù)標準品濃度得出標準曲線和換算公式，最后計算出待測樣品的濃度。每塊96孔板中取8孔作為板間對照和板內(nèi)對照。

2結(jié)果

2.1索拉非尼治療上調(diào)肝癌及癌旁組織中鼠源性SDF1-α的mRNA表達腫瘤微環(huán)境中的炎性因子在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[9]。我們收集了HCCLM3裸鼠原位瘤模型對照組、索拉非尼組的肝癌及癌旁肝組織的標本，通過RT-PCR檢測了巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等分泌的炎性因子核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)、白細胞介素-6(interleukin-6， IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、環(huán)氧合酶1(cyclooxygenase 1, COX1)、COX2和SDF1-α的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索拉非尼治療明顯上調(diào)了肝癌及癌旁肝組織中鼠源性SDF1-α的mRNA表達，而其他一些炎性因子卻沒有明顯改變(圖1A、B)，癌旁肝組織中鼠源性SDF1-α的mRNA表達遠高于肝癌組織。同時，我們還檢測了肝癌和癌旁肝組織中人源性SDF1-α的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌和癌旁肝組織中人源性SDF1-α的mRNA表達量較低，且其表達水平在索拉非尼治療前后沒有明顯變化(圖1C)。以上結(jié)果說明，SDF1-α主要由基質(zhì)細胞分泌，而非腫瘤細胞。

2.2索拉非尼上調(diào)肝癌和癌旁肝組織中鼠源性SDF1-α的蛋白表達水平我們用免疫組化法檢測肝癌及癌旁肝組織中SDF1-α蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中，SDF1-α主要來源于腫瘤細胞之間的間質(zhì)細胞，索拉非尼能明顯上調(diào)SDF1-α的表達(圖2 A、B)；SDF1-α廣泛分布于癌旁肝組織中，索拉非尼同樣能上調(diào)癌旁肝組織中的SDF1-α表達(圖2 C、D)。

因SDF1-α主要來源于癌旁肝組織，所以我們進一步用Western blotting法檢測了兩組癌旁肝組織中索拉非尼治療前后SDF1-α的表達情況。結(jié)果顯示，索拉非尼組癌旁肝組織中SDF1-α的表達明顯高于對照組(圖2E)。

2.3索拉非尼治療使裸鼠外周血血漿中鼠源性SDF1-α濃度升高用ELISA法檢測裸鼠外周血血漿中鼠源性SDF1-α的濃度發(fā)現(xiàn)，索拉非尼治療可以明顯升高外周血血漿中鼠源性SDF1-α的濃度(圖2F)。

A：RT-PCR檢測癌旁肝組織中鼠源性炎性因子的mRNA表達；B：RT-PCR檢測肝癌組織中鼠源性炎性因子的mRNA表達；C：RT-PCR檢測肝癌組織和癌旁肝組織中人源性SDF1-α的mRNA表達

圖1

A～D： 免疫組化檢測肝癌組織和癌旁肝組織中SDF1-α的表達情況，A、B為肝癌組織，C、D為癌旁肝組織；E： Western blotting檢測癌旁肝組織中SDF1-α的表達情況；F： ELISA法檢測荷瘤裸鼠外周血血漿中SDF1-α的濃度

圖2

3討論

血管生成在腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用。肝癌是多血管腫瘤，在肝癌的治療中抗血管生成非常重要[10]。索拉非尼是現(xiàn)今臨床上治療晚期肝癌的一線用藥[11]，它可以通過抑制血管生長因子受體(VEGFR)而起到抗血管生成的作用。目前，應用酪氨酸激酶抑制劑類藥物(如sunitinib、brivanib等)和抗血管生成藥物(如Bevacizumab)治療肝癌的臨床試驗也正在進行[12]。然而，有關(guān)酪氨酸激酶抑制劑在肝癌治療中的耐藥情況以及不良反應，也已見諸于報告[13]。有研究[7]指出，應用索拉非尼治療肝癌確實能夠抑制原發(fā)瘤的生長并抑制肝癌的肺轉(zhuǎn)移，但是，索拉非尼治療后腫瘤的肝內(nèi)播散灶增多，外周血腫瘤細胞數(shù)也增多。

腫瘤和癌旁微環(huán)境分泌的各種細胞因子對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移非常重要。炎性反應在癌癥發(fā)生、發(fā)展中的作用也越來越受到關(guān)注。肝臟的炎性反應狀態(tài)可能與HCC患者術(shù)后腫瘤的復發(fā)有關(guān)[14-15]。本研究用RT-PCR法檢測了裸鼠肝癌組織和癌旁肝組織中一些與炎性反應相關(guān)的細胞因子在索拉非尼治療前后的變化。結(jié)果顯示，索拉非尼治療能夠上調(diào)肝癌組織以及癌旁肝組織中鼠源性SDF1-α的表達。我們同時檢測了腫瘤組織和癌旁肝組織中人源性SDF1-α的表達，發(fā)現(xiàn)索拉非尼治療前后人源性SDF1-α的表達差異無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明，SDF1-α并非腫瘤細胞分泌的。

SDF1又稱為CXCL12，是一種趨化因子，主要由成纖維細胞、炎性細胞、內(nèi)皮細胞等基質(zhì)細胞分泌[8]。我們用免疫組化法分析肝癌組織和癌旁肝組織中SDF1-α的表達，證實了索拉非尼治療可上調(diào)SDF1-α的表達，而且SDF1-α主要來源于腫瘤組織中的間質(zhì)細胞并廣泛分布于癌旁肝組織中。我們還通過Western blotting法和ELISA法再次證實了索拉非尼能上調(diào)癌旁肝組織中的SDF1-α的表達并可升高外周血血漿中SDF1-α的濃度。有動物實驗研究[16]發(fā)現(xiàn)，對乳腺癌小鼠模型給予sunitinib治療后，外周血SDF1-α的濃度明顯升高，與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，索拉非尼治療肝癌可明顯上調(diào)肝癌微環(huán)境中SDF1-α的表達，這為我們尋找既能抑制索拉非尼的促腫瘤轉(zhuǎn)移，又能協(xié)同增強索拉非尼的療效的藥物提供了新的思路。

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Effects of Sorafentib on the Expression of SDF1-α in Hepatocellular Carcinoma Tissues and Pericarcinoma Liver Tissues

LULuZHUWenweiCHENJinhongJIAHuliangDepartmentofGeneralSurgery，HuaShanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China

AbstractObjective：To explore the mechanism of the increased invasive and metastatic potential of hepatocellular carcinoma induced by sorafenib, by studying the expression of stromal-derived factor 1-α(SDF 1-α). Methods: BALB/c nude mice models of hepatocellular carcinoma in situ were established with cell line HCCLM3. The mice were divided into sorafenib group and control group, with 6 mice in each group. Sorafenib was administered intragastrically [30 mg/(kg·d)] in sorafenib group from 2 weeks after model had been established, while 0.9% sodium chloride solution was given in the control group. Mice were killed after treating for 4 weeks. The mRNA expressions of inflammation-related factors in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues of the two groups were detected by RT-PCR. The protein expression of SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues was measured by immunohistochemistry. The protein expression of SDF1-α in pericarcinoma liver tissues was also detected by Western blotting. ELISA was performed to detect the SDF1-α concentration in peripheral blood. Results: The mRNA expression of murine SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues was significantly increased by sorafenib therapy. The results of immunohistochemistry and Western blotting showed that protein expression level of SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues was significantly up-regulated by sorafenib. The results of ELISA assay showed that the concentration of murine SDF1-α in peripheral blood was increased by sorafenib. Conclusions: The expression of SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues can be up-regulated by sorafenib therapy.

Key WordsHepatocellular carcinoma；Sorafenib；Stromal-derived factor 1-α；Invasion and metastasis

通訊作者賈戶亮，E-mail：jbl-1@163.com

中圖分類號R735.7

文獻標識碼A