頭孢曲松鈉對慢性神經(jīng)病理性疼痛的影響及其機制探討

盧麗莉，楊倩，仇艷玲，易力

(1石家莊市第三醫(yī)院，石家莊050011;2石家莊市第四醫(yī)院; 3河北省優(yōu)撫醫(yī)院)

外周神經(jīng)損傷可導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛，包括痛覺過敏、痛性感覺異常、自發(fā)性疼痛。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與脊髓水平傷害性信息的傳遞及痛覺過敏的形成;因胞外沒有谷氨酸代謝酶，胞外谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運體(GLT)。目前，已克隆出5種高親和力GLT［1，2］，其中GLT-1在病理性疼痛和痛過敏的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用［3～6］。Rothstein等［7］報道，β-內(nèi)酰胺類抗生素中的頭孢曲松(Cef)可增加GLT-1表達和谷氨酸攝取，但其是否會對慢性神經(jīng)病性疼痛過程產(chǎn)生影響尚未報道。2013年10月～2014年3月，我們觀察了Cef對大鼠坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎損傷(CCI)慢性神經(jīng)病理性疼痛的影響，并觀察脊髓后角組織中GLT-1表達的變化，為臨床上病理性疼痛的防治提供新線索與思路。

1 材料與方法

1.1 分組與造模處理 健康雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量(280±20)g。將動物隨機分為7組各10只，A組僅暴露坐骨神經(jīng)不結(jié)扎，B～F組均行右側(cè)CCI［8］制作慢性神經(jīng)病理性疼痛模型;C、E組分別于術(shù)后第1、7天開始于腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次;D、F分別與C、E組相同，均同時腹腔注射NS。7組術(shù)前第1天，A、B、E、F組術(shù)后第1、3、5、7、9、11、14天，C、D組術(shù)后第1、3、5、7天，測定熱縮足反射潛伏期、機械縮足反射閾值后，取材觀察GLT-1表達。

1.2 熱縮足反射潛伏期測定 應(yīng)用BME-410A型熱痛刺激儀(光源為12 V/35 W鹵素?zé)?進行。測痛實驗臺高36 cm，頂部為2 mm厚的石英玻璃板。將有機玻璃板制成的動物籠(220 mm×220 mm× 280 mm，無底，用有機玻璃隔板隔成3個23 mm×11 mm×28 cm的獨立空間)置于測痛實驗臺頂部的石英玻璃板上，將待測動物置于籠內(nèi);調(diào)節(jié)光源與石英玻璃板之間的距離，使落在足底的照射光圈直徑5 mm，從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時間(s)即為熱刺激縮足潛伏期。重復(fù)測量5次，同一部位間隔10 min，不同部位間隔5 min，取平均值。如＞30 s無反應(yīng)，則停止照射，以免導(dǎo)致大鼠足底組織過熱損傷。

1.3 機械縮足反射閾值測定 應(yīng)用von-Frey纖維機械刺激器，包括12種刺激強度(0.09、0.18、0.28、0.52、1.12、3.80、5.50、7.70、10.40、18.20、44.00、 61.00 g)。將透明有機玻璃動物籠置于頂部為鐵絲網(wǎng)的36 cm高的測痛實驗臺上，將待測大鼠置于籠中。實驗者手持纖維穿過鐵絲網(wǎng)格分別刺激大鼠兩側(cè)足底中心部位，刺激強度由小到大，每個強度刺激10次(次與次間隔3～5 s)，將出現(xiàn)縮足反應(yīng)5次以上的強度定為大鼠對機械刺激的反應(yīng)閾值。刺激閾值刺激閾值＞61.00 g均以61.00 g計，＜0.09 g均以0.09 g計。

1.4 脊髓后角GLT-1檢測 采用Western blot法。在預(yù)定時間點，將動物迅速斷頭處死，取出L4、L5脊髓節(jié)段，將所取標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h備用。取L4、L5脊髓節(jié)段，切取右側(cè)脊髓后角;稱重后加入10倍體積的預(yù)冷裂解液，在冰浴下制成勻漿。4℃ 12 000 g離心 10 min，取上清－70℃保存。采用考馬斯亮藍法測定組織蛋白含量后，電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫顯色;應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行相對定量分析，以各處理組樣本與β-actin蛋白的IOD值之比作為蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)用s表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組內(nèi)比較應(yīng)用配對t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組熱縮足反射潛伏期比較 見表1。

表1 各組熱縮足反射潛伏期比較(s，s)

表1 各組熱縮足反射潛伏期比較(s，s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，△P＜0.05;與F組比較，#P＜0.05。

組別 術(shù)前1 d 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d 術(shù)后9 d 術(shù)后11 d 術(shù)后14 d A組 15.2±1.8 14.0±1.1 15.4±0.8 14.6±1.4 13.5±1.6 13.7±0.8 14.5±1.7 13.9±1.2 B組 14.0±0.9 14.2±0.7 9.5±1.4* 6.6±1.2* 7.5±1.1* 7.4±1.7* 7.2±1.0* 7.7±1.7* C組 14.4±1.2 14.6±1.1 9.2±1.0 9.6±0.5△ 12.3±1.7△ － － －D組 14.1±0.7 14.6±0.4 9.8±0.2 7.1±1.9 6.9±0.7 － － －E組 14.0±1.1 13.7±1.0 9.5±0.6 6.9±1.6 7.7±1.9 7.7±0.5 10.3±0.7# 12.1±1.0# F組 14.3±1.4 14.2±0.8 8.5±0.8 5.8±0.7 7.2±1.3 6.5±1.6 6.7±0.3 6.6±1.1

2.2 各組機械縮足反射閾值比較 各組機械縮足 反射閾值比較，見表2。

表2 各組機械縮足反射閾值比較(g，s)

表2 各組機械縮足反射閾值比較(g，s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，△P＜0.05;與F組比較，#P＜0.05。

組別 術(shù)前1 d 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d 術(shù)后9 d 術(shù)后11 d 術(shù)后14 d A組 42.1±14.1 38.8±11.5 42.1±14.1 42.1±14.1 48.5±11.5 48.5±11.5 42.1±14.1 42.1±14.1 B組 33.6±14.1 38.8±11.6 10.8±4.3* 7.6±2.9* 6.5±1.8* 7.4±2.7* 6.2±1.9* 4.8±2.0* C組 38.2±16.9 42.5±13.7 10.8±3.9 13.0±4.0 26.8±11.5△ － － －D組 35.4±14.9 26.8±14.9 15.6±4.5 8.6±1.6 7.0±1.3 － － －E組 33.7±14.1 33.7±14.1 14.3±4.5 8.4±1.4 7.2±1.1 9.1±1.5 12.0±3.9 24.7±12.9# F組 35.4±14.9 35.3±15.0 13.0±4.5 9.5±1.6 7.0±1.3 7.3±3.3 5.7±2.0 5.1±2.3

2.3 各組脊髓后角GLT-1蛋白表達比較 A組可見脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達，CCI后脊髓后角GLT-1蛋白表達出現(xiàn)雙向性變化;與A組相比較，B組CCI后第1、3、5天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達顯著升高，CCI后第7、9、11、14天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達下降，P均＜0.05。C組CCI后第7天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達較D組顯著升高(P＜0.05)，E組CCI后第14天脊髓后角組織中GLT-1蛋白表達較F組顯著升高(P＜0.05)。見表3。

表3 各組脊髓后角GLT-1蛋白表達比較(s)

表3 各組脊髓后角GLT-1蛋白表達比較(s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與D組比較，△P＜0.05;與F組比較，#P＜0.05。

組別 術(shù)前1 d 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d 術(shù)后9 d 術(shù)后11 d 術(shù)后14 d A組 1.60±0.12 1.50±0.11 1.50±0.21 1.60±0.13 1.60±0.22 1.50±0.15 1.60±0.23 1.60±0.13 B組 1.50±0.21 2.20±0.13* 2.70±0.11* 3.30±0.23* 0.70±0.04* 0.50±0.02* 0.50±0.03* 0.40±0.15* C組 1.70±0.13 2.30±0.12 2.70±0.23 3.30±0.21 2.60±0.08△ － － －D組 1.60±0.14 2.20±0.21 2.60±0.13 3.20±0.17 0.60±0.03 － － －E組 1.50±0.14 2.30±0.19 2.70±0.12 3.20±0.21 0.80±0.04 0.50±0.03 0.70±0.05 3.10±0.18# F組 1.60±0.13 2.30±0.18 2.60±0.14 3.30±0.17 0.70±0.10 0.60±0.05 0.50±0.03 0.40±0.02

3 討論

CCI模型是目前神經(jīng)病理性疼痛研究中應(yīng)用最廣泛的模型，制作簡便、穩(wěn)定，能較好地模擬臨床神經(jīng)損傷后的痛覺過敏現(xiàn)象［8］。CCI模型的特點是用鉻制羊腸線輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)，使粗的有髓鞘纖維選擇性的損傷，但仍保留大部分傳遞疼痛的C類纖維。模型動物術(shù)后第3天開始出現(xiàn)痛覺過敏，第5～7天降到最低，痛覺異常狀態(tài)可持續(xù)2～3個月。本實驗觀察到，CCI大鼠術(shù)后第1天在坐骨神經(jīng)壓迫側(cè)即可見足趾部卷曲、足外翻、跋行，行走時著地時間明顯縮短，足部邊緣著地，有明顯的后肢保護現(xiàn)象出現(xiàn)。術(shù)后第3天，坐骨神經(jīng)壓迫側(cè)出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象，熱縮足反射潛伏期和械縮足反射閾值開始降低，到術(shù)后第5～7天達最低值，持續(xù)到所測試的第14天。這些變化同文獻報道一致［8］。本研究還發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠CCI側(cè)脊髓后角GLT-1表達出現(xiàn)雙向性變化，術(shù)后第1、4天表達明顯升高，第7、14天表達減少。GLT后期階段的下調(diào)同與CCI大鼠熱縮足反射潛伏期和械縮足反射閾值降低相一致，因此推測GLT-1對CCI導(dǎo)致的慢性神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持具有重要作用。

最近研究發(fā)現(xiàn)［7］，15種β-內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素和一些新的衍生物)具有出人意料的新功能，其中Cef可通過血腦屏障進入腦和脊髓。連續(xù)腹腔注射Cef 6～7 d后，可以選擇性地誘發(fā)編碼GLT-1谷氨酸轉(zhuǎn)運體的基因轉(zhuǎn)錄，增加GLT-1的腦內(nèi)表達，并增強其功能活性。本實驗在CCI術(shù)后第1、7腹腔注射Cef，注射7 d后大鼠的熱刺激潛伏期和機械縮足潛伏期明顯延長，且CCI側(cè)脊髓后角GLT-1表達明顯增加。表明Cef可通過激動GLT-1對疼痛起到預(yù)防和治療作用。

CCI導(dǎo)致的神經(jīng)損傷誘導(dǎo)了脊髓谷氨酸的釋放及GLT的過度激活，最初GLT的上調(diào)為一種保護性的機制［9］，攝取突觸間隙的谷氨酸，減少這種過度激活導(dǎo)致的有害影響。盡管GLT的最初上調(diào)不能完全阻止神經(jīng)病理性痛的發(fā)展，但是在阻礙慢性病理性疼痛發(fā)展方面發(fā)揮了重要作用［10］。有研究表明，神經(jīng)損傷后反饋性GLT上調(diào)，Trk受體和MAPK也發(fā)揮了積極的作用［11］;后期GLT下調(diào)，可能是由于失去了初級傳入引起的，而且脊髓中的退化性變化也部分導(dǎo)致脊髓膠質(zhì)細(xì)胞型GLT的下調(diào)。脊髓GLT表達減少可致脊髓谷氨酸蓄積［12］，使谷氨酸受體過度的激活，產(chǎn)生自發(fā)性痛和痛覺過敏。本研究應(yīng)用Cef激動GLT-1表達后，抑制了CCI后期脊髓GLT表達的下降，使脊髓細(xì)胞間隙谷氨酸不會造成慢性蓄積，從而減輕了熱痛敏和機械痛敏的產(chǎn)生;為臨床上預(yù)防和治療慢性神經(jīng)病理性體提供了新的依據(jù)與思路。

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