人參皂苷預(yù)處理對(duì)電離輻射下人造血干細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制探討

黃穎，梁曉燕，李騁進(jìn)，胡軍，康曉莉

(陜西省人民醫(yī)院，西安710068)

隨著放射療法在腫瘤患者中的大量應(yīng)用，因放射所致組織細(xì)胞損傷備受關(guān)注，其中人造血干細(xì)胞(HPCs)最易受到輻射影響［1］。研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射可誘導(dǎo)HPCs產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，從而引起HPCs氧化應(yīng)激［2，5］，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生突變［3］，甚至發(fā)生癌變［4］。Nrf-2可經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯出一些抗氧化物質(zhì)，對(duì)抗氧化應(yīng)激作用［6］。Caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)子，被證實(shí)參與電離輻射所致細(xì)胞凋亡過(guò)程［7，8］。人參皂苷作為人參內(nèi)主要的藥理活性成分［9］，具有很強(qiáng)的抗炎和抗氧化作用，可明顯抑制心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞在病理?xiàng)l件下發(fā)生的凋亡和氧化應(yīng)激［10，11］。目前，關(guān)于人參皂苷對(duì)電離輻射下HPCs的保護(hù)作用還未見(jiàn)報(bào)道。2014年1～11月，我們通過(guò)體外分離培養(yǎng)HPCs，觀察人參總皂苷對(duì)不同強(qiáng)度電離輻射下HPCs是否有一定保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶由美國(guó)Gibco公司提供;人參皂苷購(gòu)自吉林省宏久生物技術(shù)股份有限公司;CD+34細(xì)胞選擇試劑盒、MTT試劑盒、AV/PI雙染試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒等購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司;Caspase-3和Nrf-2的一抗和二抗購(gòu)于武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPCs的分離培養(yǎng) 臍帶血由陜西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科采集。供者要求:身體健康，發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦;無(wú)遺傳病史，無(wú)血液系統(tǒng)疾病，無(wú)寄生蟲及地方病;HIV、肝炎、梅毒等檢測(cè)均為陰性;供者知情同意。每次采集臍血50～120 mL。采用磁珠細(xì)胞分選免疫磁性吸附柱分離裝置，用CD+34細(xì)胞選擇試劑盒按說(shuō)明分離與純化CD+34細(xì)胞，培養(yǎng)21 d。

1.2.2 HPCs電離輻射處理 將細(xì)胞以1×103接種于96孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組;對(duì)照組不處理，觀察組予以5.0 μmol/L人參皂苷0.2 mL/孔預(yù)處理24 h。兩組用直線加速器行X射線照射，劑量率為2.60 Gy/min，照射時(shí)間分別為0、23、46、115 s，輻射劑量分別為0、1、2、5 Gy。然后加入新鮮的培養(yǎng)基，37℃下置入5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 HPCs活性檢測(cè) 采用MTT法。按照操作說(shuō)明書，先將1 mg/mL的MTT加入各組細(xì)胞內(nèi)，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3 h。倒掉培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，上酶標(biāo)儀于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 ROS水平測(cè)定 電離輻射后24 h，每個(gè)樣本收集細(xì)胞約5×105;按照說(shuō)明書向各實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)添加50 μmol H2DCFDA，37℃避光染色30 min。收集各孔內(nèi)細(xì)胞，用PBS液清洗后進(jìn)行重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè);調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)至490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm，用 CellQuest軟件以熒光相對(duì)強(qiáng)度表示 ROS水平。

1.2.5 Caspase-3和Nrf-2檢測(cè) 采用Western blot法。將各組細(xì)胞以1×106接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，按照每200萬(wàn)細(xì)胞100 μL裂解液的比例加入裂解液提取細(xì)胞。取出所需測(cè)定的樣品，沸水中煮5 min使蛋白變性;置入0.5 mL的離心管內(nèi)，加入5×SDS的緩沖液。按照說(shuō)明書對(duì)樣品進(jìn)行電泳、顯影，將膠片拍照，用Image Pro Plus對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)以s表示，采用t檢驗(yàn)及方差分析。P≤ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較(s)

表1 兩組細(xì)胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較(s)

注:與同組0 Gy比較，*P＜0.05;與對(duì)照組同輻射劑量比較，#P＜0.05。

組別 細(xì)胞存活率(%) ROS活性157±7.44觀察組0 Gy 96.48±5.04 136±6.66 1 Gy 93.35±4.48# 138±5.97# 2 Gy 91.33±4.05# 142±6.78# 5 Gy 89.15±4.22# 137±6.63#對(duì)照組0 Gy 97.23±5.12 140±6.68 1 Gy 82.05±4.19* 158±7.99* 2 Gy 74.54±3.57* 180±8.26* 5 Gy 61.07±3.69*

2.2 兩組細(xì)胞Caspase-3、Nrf-2表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞Caspase-3、Nrf-2表達(dá)比較(s)

表2 兩組細(xì)胞Caspase-3、Nrf-2表達(dá)比較(s)

注:與同組0 Gy比較，*P＜0.05;與對(duì)照組同輻射劑量比較，#P＜0.05。

組別Caspase-3 Nrf-2 1.21±0.04觀察組0 Gy 1.28±0.04 1.17±0.06 1 Gy 1.53±0.05*# 1.73±0.09*# 2 Gy 1.61±0.05*# 1.94±0.10*# 5 Gy 1.83±0.06*# 2.28±0.12*#對(duì)照組0 Gy 1.27±0.04 1.15±0.04 1 Gy 1.84±0.05* 1.24±0.04 2 Gy 1.96±0.06* 1.16±0.03 5 Gy 2.31±0.07*

3 討論

人的造血組織對(duì)電離輻射非常敏感。據(jù)報(bào)道，1～7 Gy的電離輻射均會(huì)誘導(dǎo)HPCs發(fā)生不同程度的損傷［12］，我們選取1～5 Gy進(jìn)行研究［13］。研究證實(shí)，5.0 μmol/L的人參皂苷抗氧化作用顯著［14］，所以我們以5.0 μmol/L人參皂苷做為實(shí)驗(yàn)劑量。

本研究結(jié)果顯示，受到電離輻射的HPCs活性明顯下降，而且這種下降趨勢(shì)可被人參皂苷所抑制。我們知道，MTT是通過(guò)測(cè)定線粒體膜上的琥珀酸脫氫酶的活性來(lái)測(cè)定細(xì)胞活性的［15］，從而我們推斷，人參總皂苷的這種作用正是通過(guò)對(duì)線粒體產(chǎn)生保護(hù)作用實(shí)現(xiàn)的，而線粒體正是 ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所［16］。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞經(jīng)輻射繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，大量細(xì)胞已經(jīng)死亡，但整體的ROS水平仍明顯高于對(duì)照組。其原因可能為殘存的細(xì)胞為避免發(fā)生凋亡繼續(xù)增殖，而增殖過(guò)程中可產(chǎn)生大量的ROS［17］。但是，5 Gy劑量電離輻射下，HPCs的ROS水平已經(jīng)基本持平，可能與高劑量的電離輻射激活某種抗氧化機(jī)制有關(guān)［18］。但是，當(dāng)我們用人參總皂苷處理HPCs后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，從而減緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Caspase-3為半胱氨酸蛋白酶家族的一個(gè)重要成員，在細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要的作用。它是死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵啟動(dòng)子，其活性增強(qiáng)一般說(shuō)明細(xì)胞即將向凋亡進(jìn)展［20］。本研究顯示，電離輻射可誘導(dǎo) HPCs內(nèi)Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，而人參皂苷可有效抑制Caspase-3表達(dá)，這可能是人參皂苷抑制電離輻射誘導(dǎo)HPCs凋亡的一個(gè)作用機(jī)制。Nrf-2是一種與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它可以直接激活細(xì)胞內(nèi)含抗氧化基因的蛋白表達(dá)，從而起到對(duì)抗細(xì)胞氧化的作用［21］;另外，Nrf-2還可有效抑制各種病理狀態(tài)下引起的線粒體功能改變［22］。本結(jié)果顯示，在電離輻射的作用下，HPCs內(nèi)的Nrf-2蛋白隨著輻射增強(qiáng)呈下降趨勢(shì)，用人參皂苷處理后其表達(dá)增加，提示人參皂苷抗氧化作用可能與促進(jìn)Nrf-2表達(dá)有關(guān)。但是，人參皂苷含有Rb3、Rg1、Rf2、Rh2和Rd等多種活性成分，而其激活Nrf-2的表達(dá)到底是哪種單體起作用，需要進(jìn)一步研究。

［1］Floratou K，Giannopoulou E，Antonacopoulou A，et al.Oxidative stress due to radiation inhematopoietic progenitor cells:protection by IGF-1［J］.J Radiat Res，2012，53(5):672-685.

［2］Wang Y，Liu L，Pazhanisamy SK，et al.Total body irradiation causes residual bone marrow injury by induction of persistent oxidative stress in murine hematopoietic stem cells［J］.Free Radic Biol Med，2010，48(2):348-356.

［3］Tominaga H，Kodama S，Matsuda N，et al.Involvement of reactive oxygen species(ROS)in the induction of genetic instability by radiation［J］.J Radiat Res，2004，45(2):181-188.

［4］Huang L，Snyder AR，Morgan WF.Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis［J］.Oncogene，2003，22(37):5848-5854.

［5］Bowler DA，Moore SR，Macdonald DA，et al.Bystander-mediated genomic instability after high LET radiation in murine primary haemopoietic stem cells［J］.Mutat Res，2006，597(1-2):50-61.

［6］Jain AK，Bloom DA，Jaiswal AK.Nuclear import and export signals in control of Nrf2［J］.J Biol Chem，2005，280(32): 29158-29168.

［7］Simon HU，Haj-Yehia A，Levi-Schaffer F.Role of reactive oxygen species(ROS)in apoptosis induction［J］.Apoptosis，2000，5 (5):415-418.

［8］Samuni AM，Kasid U，Chuang EY，et al.Effects of hypoxia on radiation-responsive stress-activated protein kinase， p53， and caspase 3 signals in TK6 human lymphoblastoid cells［J］.Cancer Res，2005，65(2):579-586.

［9］Qi LW，Wang CZ，Yuan CS.Ginsenosides from American ginseng:chemical and pharmacological diversity［J］.Phytochemistry，2011，72(8):689-699.

［10］Liu Q，Kou JP，Yu BY.Ginsenoside Rg1 protects against hydrogen peroxide-induced cell death in PC12 cells via inhibiting NF-kappa B activation［J］.Neurochem Int，2011，58(1):119-125.

［11］Wang Y，Li X，Wang X，et al.Ginsenoside Rd attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via Akt/GSK-3beta signaling and inhibition of the mitochondria-dependent apoptotic pathway［J］.PLoS One，2013，8(8):e70956.

［12］Mauch P，Constine L，Greenberger J，et al.Hematopoietic stem cell compartment:acute and late effects of radiation therapy and chemotherapy［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1995，31(5): 1319-1339.

［13］Campbell BA，Voss N，Woods R，et al.Long-term outcomes for patients with limited stage follicular lymphoma:involved regional radiotherapy versus involved node radiotherapy［J］.Cancer，2010，116(16):3797-3806.

［14］Ma L，Liu H，Xie Z，et al.Ginsenoside Rb3 protects cardiomyocytes against ischemia-reperfusion injury via the inhibition of JNK-mediated NF-kappaB pathway:a mouse cardiomyocyte model［J］.PLoS One，2014，9(8):e103628.

［15］Dreiem A，Gertz CC，Seegal RF.The effects of methylmercury on mitochondrial function and reactive oxygen species formation in rat striatal synaptosomes are age-dependent［J］.Toxicol Sci，2005，87 (1):156-162.

［16］Cho YS，Challa S，Moquin D，et al.Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation［J］.Cell，2009，137(6): 1112-1123.

［17］Hayashi T，Hayashi I，Shinohara T，et al.Radiation-induced apoptosis of stem/progenitor cells in human umbilical cord blood is associated with alterations in reactive oxygen and intracellular pH［J］.Mutat Res，2004，556(1-2):83-91.

［18］Summers RW，Maves BV，Reeves RD，et al.Irradiation increases superoxide dismutase in rat intestinal smooth muscle［J］.Free Radic Biol Med，1989，6(3):261-270.

［19］Vermes I，Haanen C，Steffens-Nakken H，et al.A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V［J］.J Immunol Methods，1995，184(1):39-51.

［20］Paroni G，Henderson C，Schneider C，et al.Caspase-2-induced apoptosis is dependent on caspase-9，but its processing during UV-or tumor necrosis factor-dependent cell death requires caspase-3［J］.J Biol Chem，2001，276(24):21907-21915.

［21］Johnson JA，Johnson DA，Kraft AD，et al.The Nrf2-ARE pathway:an indicator and modulator of oxidative stress in neurodegeneration［J］.Ann N Y Acad Sci，2008(1147):61-69.

［22］Ludtmann MH，Angelova PR，Zhang Y，et al.Nrf2 affects the efficiency of mitochondrial fatty acid oxidation［J］.Biochem J，2014，457(3):415-424.