柱前衍生化HPLC法測定不同基源金線蓮多糖的單糖組成Δ

吳巖斌，張秀才，易 駿，鄭淑霞，吳建國，譚春江，吳錦忠#（.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350；.福建教育學(xué)院理科部，福州 35000）

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）為蘭科開唇蘭屬植物，是一種多年生的珍貴中草藥，喜陰濕環(huán)境，常生長在山地林下或溝谷陰濕處，主要分布于我國浙江、江西、福建、云南和臺灣等地[1]。金線蓮在民間素有“藥王”之美譽(yù)，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕等功效，可用于治療腎炎、膀胱炎、糖尿病、支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒急驚風(fēng)等癥[2]。目前的研究認(rèn)為金線蓮的主要活性成分為黃酮類、多糖類和內(nèi)酯類成分[3-6]，具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤、保肝、抗菌和降血脂等生物活性[6-11]，臨床主要用于治療手足口病、糖尿病、高尿酸血癥和肝炎等[12-15]，其藥用價(jià)值在閩臺地區(qū)深受青睞。關(guān)于金線蓮原植物的來源，一直以來存在較大爭議，2014版《全國中草藥匯編》收載的金線蓮植物來源包括花葉開唇蘭（Anoectochilus.roxburghii（Wall.）Lindl.）和臺灣銀線蘭（A.formosanusHayata）[1]，2006版《福建中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載的金線蓮來源于花葉開唇蘭[2]。目前，市場上流通的金線蓮藥用品種主要有花葉開唇蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭（A.chapaensisGagnep），民間常把這3種植物都當(dāng)成金線蓮使用[16]。近年來，市場對金線蓮的需求增加，使得野生金線蓮日漸匱乏，目前市場上流通的金線蓮幾乎都是通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得。其組織培養(yǎng)的外植體基源選擇缺乏標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，因此市場較為混亂，亟需科學(xué)的方法對同名異物的金線蓮藥用品種加以鑒別。

一般來說，多糖的生物活性與其單糖組成密切相關(guān)，而且多糖的單糖組成分析是進(jìn)行多糖質(zhì)量控制的重要依據(jù)。金線蓮多糖是金線蓮的主要活性成分之一，具有降血糖、抗腫瘤和抗氧化等生物活性[6-8]。目前，對于不同基源的金線蓮多糖的單糖組成比較分析還未見報(bào)道。為此，筆者對花葉開唇蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭這3種金線蓮多糖的單糖組成進(jìn)行了研究，旨在為開唇蘭屬的品種鑒定及金線蓮的質(zhì)量控制提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

花葉開唇蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭均采自福建福州北峰，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒定，憑證標(biāo)本存放在福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院。單糖對照品（甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖）均購自中國食品藥品檢定研究院；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）[阿拉丁試劑（上海）有限公司，純度：99.0%]；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1200系列高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）；AB204-N電子天平（瑞士Mettler-Toledo有限公司）；雙列四孔數(shù)顯水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SH2-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DLSB-5/25 ℃低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 金線蓮多糖的提取

采用水提醇沉法提取金線蓮多糖。取花葉開唇蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭各10.0 g，加入80%乙醇100 ml，回流脫脂，過濾，殘?jiān)尤?0倍量的水，回流提取3次，過濾，合并多糖提取液；將提取液濃縮后緩慢加入無水乙醇，至溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，4 ℃靜置過夜；以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集多糖沉淀，置于55 ℃烘箱內(nèi)干燥，即為金線蓮粗多糖粉末。采用Sevag法除蛋白，紫外檢測無蛋白與核酸吸收后，減壓濃縮冷凍干燥，得到花葉開唇蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭多糖樣品。

2.2 金線蓮多糖的水解[17]

精密稱取金線蓮多糖樣品100 mg于具塞試管，加水1 ml溶解，加入2 mol/L三氟乙酸1 ml，封口后于110 ℃烘箱內(nèi)水解2 h，冷卻至室溫，用3 mol/L NaOH溶液中和至pH為7.0，蒸餾水定容至刻度，以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心10 min，取上清液用于PMP衍生化。

2.3 單糖對照品的衍生化[18-19]

分別精密稱取甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖對照品5.1、5.3、5.0、5.3、4.8、5.2 mg，置于2 ml容量瓶中，加水溶解，定容至刻度。精密吸取50 μl分別加入0.3 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L PMP-甲醇溶液各50 μl，混勻后于70 ℃水浴中加熱反應(yīng)100 min，并不時(shí)振搖。取出，冷卻至室溫后，加入0.3 mol/L HCl溶液50 μl至pH為7.0，加去離子水800 μl，混勻；再加入CHCl31 ml萃取，充分振蕩，以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心10 min，吸棄下層有機(jī)相，重復(fù)3次，合并上層水相，水相溶液定容至1 ml，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，供HPLC進(jìn)樣分析用。

2.4 樣品的衍生化

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的不同基源金線蓮多糖的水解液各100 μl，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，即得花葉開唇蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭多糖衍生化樣品。

2.5 色譜條件

色譜柱：Alltima-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（NaH2PO4-Na2HPO4，pH＝6.7）-乙腈（83∶17，V/V），流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：30 μl。

2.6 線性關(guān)系考察

取衍生化后的單糖混合對照品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10、15、20、25、30、50、75、100 μl，記錄峰面積。以各單糖的進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程和線性范圍Tab 1 Regression equation and linear range

2.7 精密度試驗(yàn)

取衍生化后的單糖混合對照品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為0.13%、0.59%、0.49%、0.35%、0.35%、1.04%，表明儀器精度度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取金線蓮多糖水解衍生化后的溶液，分別于放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.94%、2.18%、1.82%、1.96%、1.79%、2.37%，表明衍生化后的金線蓮多糖水解液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密取金線蓮多糖樣品6份，每份約100 mg，經(jīng)衍生化處理后按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為0.76%、0.99%、1.48%、1.21%、0.68%、2.24%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取6份金線蓮多糖樣品，每份100 mg，加入單糖混合對照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法水解衍生化處理后，分別按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.11 金線蓮多糖中的單糖組成分析

將單糖混合對照品圖譜與3種不同基源金線蓮的多糖色譜圖進(jìn)行對照（見圖1），并根據(jù)單糖峰面積計(jì)算多糖中單糖的含量和物質(zhì)的量之比（見表3），可以確定花葉開唇蘭多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量之比為2.52∶0.53∶1.00∶5.07∶1.58；臺灣銀線蘭多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量之比為1.10∶0.50∶1.00∶1.92；滇越金線蘭多糖由甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量之比為2.95∶0.28∶0.53∶1.00∶9.30∶2.26。其中半乳糖在福建金線蓮、臺灣金線蓮和滇越金線蓮中各單糖所占的比例最高，甘露糖次之。

圖1 3種不同基源金線蓮多糖和單糖對照品PMP衍生物的HPLC色譜圖A.花葉開唇蘭；B.臺灣銀線蘭；C.滇越金線蘭；D.單糖對照品；1.甘露糖；2.葡糖醛酸；3.半乳糖醛酸；4.葡萄糖；5.半乳糖；6.阿拉伯糖Fig 1 HPLC chromatograms of derivative of A.roxburghii polysaccharides from 3 different origins and monosaccharides and refevence PMPA.A.roxburghii；B.A.formosanus；C.A.chapaensis；D.monosaccharide reference；1.mannose；2.glucuronic acid；3.galacturonic acid；4.glucose；5.galactose；6.arabinose

表3 3種不同基源金線蓮多糖的單糖組成測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of the determination of monosaccharide composition in A.roxburghii polysaccharides from 3 different origins（n＝3）

3 討論

糖類化合物一般缺乏特征的紫外吸收，為提高其在HPLC檢測中的靈敏度，常常采用衍生化的方法使其形成具有紫外或熒光吸收的衍生物。衍生化試劑PMP是一種酸性化合物，可與還原糖發(fā)生醛基反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收，近年來常用于單糖衍生化方法。本試驗(yàn)建立的PMP柱前衍生化HPLC法分析開唇蘭屬植物多糖的單糖組成方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度較高，可同時(shí)分離檢測多種單糖，可用于金線蓮多糖的單糖組成測定，并可望進(jìn)一步推廣應(yīng)用于其他開唇蘭屬植物多糖的分析。

金線蓮多糖具有多種生物活性，研究其多糖中的單糖組成，對了解人工組織培養(yǎng)的金線蓮藥材質(zhì)量、保證金線蓮藥材和產(chǎn)品的合格性，具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。至于不同基源金線蓮多糖的藥理活性是否存在差異，有待進(jìn)一步研究。金線蓮還含有黃酮類和內(nèi)酯類等有效成分，僅以多糖的組成作為金線蓮藥材的質(zhì)量控制方法有一定的局限性，但對金線蓮多糖的構(gòu)效關(guān)系研究具有一定的指導(dǎo)意義。

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