茯苓皮藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

宋 瀟，謝昭明，黃 丹，劉塔斯，鄧富民，舒志芬，劉金香，冉玲菊，李如意（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)/湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙 40208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，長沙 4003）

茯苓皮為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf干燥菌核的黑色外皮，性平，味甘、淡[1]。其具有利水消腫的作用，主要用于治療小便不利、水腫[2]。茯苓野生資源很少、不易發(fā)現(xiàn)和采挖，全國雖有近20個省栽培茯苓，但茯苓主要產(chǎn)于安徽、湖北、湖南、云南、貴州等地[3]。隨著《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（試行）》（GAP）的實施和推廣，茯苓皮藥材質(zhì)量與產(chǎn)地相關(guān)性的研究意義逐漸突出。中藥指紋圖譜為新興的中藥質(zhì)量研究可行性手段之一[4]。本文對全國茯苓栽培產(chǎn)地的18批茯苓皮藥材進行了高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜方法學(xué)研究，以期通過建立茯苓皮藥材HPLC指紋圖譜的質(zhì)量評價方法，為茯苓皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和GAP種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1260型HPLC儀，包括二極管陣列（DAD）檢測器、在線真空脫氣機、四元梯度泵、柱溫箱（美國Agilent公司）；色譜數(shù)據(jù)的采集與處理由Agilent化學(xué)工作站完成；KQ2200B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

茯苓酸A對照品（成都克洛瑪有限公司，批號：140213）；甲醇、磷酸、乙腈（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

本試驗所用茯苓皮藥材經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所謝昭明研究員鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf干燥菌核的黑色外皮，共18批。18批茯苓皮藥材來源見表1。

表1 18批茯苓皮樣品來源Tab 1 Origins of 18 batches of Cortex Poriae samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～25 min，40%～48%A；25～40 min，48%A；40～50 min，48%～75%A；50～76 min，75%～90%A；76～80 min，90%～100%A）；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；記錄時間：85 min。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取茯苓酸A對照品6.7 mg，置于50 mg量瓶中，加流動相[乙腈-0.1%磷酸水（70∶30，V/V）]溶解并稀釋至刻度。

2.3 供試品溶液的制備

取茯苓皮藥材粉末（過80目篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50 ml甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理20 min，冷卻，補足損失的甲醇量，過濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3.0%，表明方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批茯苓皮藥材粉末（過80目篩）6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3.0%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.5 茯苓皮HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 根據(jù)18個產(chǎn)地茯苓皮藥材供試品溶液HPLC圖提供的相關(guān)參數(shù)，建立茯苓皮藥材三萜類成分的HPLC指紋圖譜（圖1）。比較18批茯苓皮樣品的色譜圖，確定了16個共有峰。其中7號峰峰面積較大，經(jīng)對照品比對歸屬為茯苓酸A，且在不同批次樣品中均穩(wěn)定存在，故選其為參照峰，其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積均通過7號峰比對獲得。結(jié)果顯示，各個共有峰的相對保留時間的RSD均＜3.0%，但各個共有峰的相對峰面積的RSD有很大差異，以峰1、5、8、15、16所代表成分最為明顯，說明這5個色譜峰所代表的成分在各藥材樣品中的量存在很大差異（圖2）。

圖1 18批茯苓皮藥材的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 18 batches of Cortex Poriae

2.5.2 相似度評價 首先對18批茯苓皮樣品進行系統(tǒng)聚類分析，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用組間均聯(lián)法（Between group linkage），以夾角余弦（Consine）作為樣品的分類依據(jù)。18批樣品可分為兩類，樣品3、6、9、14批為一類；樣品1、2、4、5、7、8、10、11、12、13、15、16、17、18批為另一類，聚類分析結(jié)果見圖3。

圖2 18批茯苓皮藥材共有峰的HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of 18 batches of Cortex Poriae common peak

圖3 18批茯苓皮藥材的聚類分析圖Fig 3 Cluster analysis of 18 batches of Cortex Poria

采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004版）對所得的色譜數(shù)據(jù)進行處理，通過多點校正的方法對色譜峰進行自動匹配生成樣品的色譜指紋圖譜共有模式，以第7批藥材圖譜作為參照圖譜，進行相似度計算，結(jié)果見表2。結(jié)果，3、6、9、14批樣品相似度小于0.95，其余樣品相似度均在0.95以上。此結(jié)果與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致，2種方法得到了相互驗證，因此可以認(rèn)為相似度在0.95以上的為推薦品，0.95以下的為非推薦品。

表2 18批茯苓藥材的相似度評價結(jié)果Tab 2 Results of similarity evaluation of 18 batches of Cortex Poriae

3 討論

3.1 提取溶劑和方法的考察

對提取溶劑甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯進行考察，以甲醇提取的樣品色譜峰個數(shù)較多、峰面積較大，故提取溶劑選擇甲醇。筆者對超聲提取法和加熱回流提取法進行比較，2種提取方法提取效率相當(dāng)，考慮到超聲提取法操作較簡便，故提取方法選擇超聲提取法；同時又對不同的提取時間（10、20、30、40 min）進行考察，20 min及以后的提取效率基本一致，故選擇超聲時間為20 min。故確定提取方法為甲醇超聲20 min。

3.2 色譜條件的考察

筆者分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸4個流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明采用乙腈-水-磷酸流動相系統(tǒng)時，各峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析，因此確定乙腈-水-磷酸作為本研究的流動相[5]。隨后又分別考察了25、30、35 ℃3個檢測柱溫，結(jié)果表明色譜柱檢測溫度在35 ℃時，分離度最好、峰形較好。故選擇柱溫為35 ℃條件下進行茯苓皮藥材HPLC指紋圖譜檢測。

3.3 檢測波長的選擇

使用DAD檢測器進行紫外區(qū)全波長掃描，在210 nm波長下，色譜圖基線噪音較低，特征峰響應(yīng)較高，色譜峰信息較完全。綜合比較后，選擇210 nm作為本研究的檢測波長。

綜上所述，本試驗建立了茯苓皮藥材的HPLC指紋圖譜，并采用不同分析方式將18批茯苓皮藥材分為兩大類[6]。雖然上述兩大類茯苓皮HPLC指紋圖譜十分相似，但3、6、9、14批茯苓皮樣品的各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于其他批號茯苓皮樣品，表明3、6、9、14批茯苓皮樣品質(zhì)量次于其他批號的茯苓皮樣品。由此提示茯苓皮藥材的質(zhì)量與土壤類型、蓋土厚度、海拔、緯度、氣候條件、菌種、種植方法等密切相關(guān)，其具體原因有待進一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：224.

[2]張怡莎，陳華國，周欣，等.不同產(chǎn)地茯苓及茯苓皮中多糖成分的研究[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，28（3）：101.

[3]於小波，昝俊峰，王金波，等.我國茯苓藥材主要產(chǎn)區(qū)資源調(diào)查[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（3）：714.

[4]張琦，王振中，蕭偉，等.茯苓UPLC特征指紋圖譜[J].中國中藥雜志，2012，37（7）：966.

[5]曾超，陸東，段偉昌，等.肉桂配方顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2014，25（7）：635.

[6]陳蓉，沈蓓，吳啟南.基于主成分分析和聚類判別模式對不同產(chǎn)地芡實HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2012，34（5）：781.