窄譜中波紫外線對(duì)體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞增殖及代謝影響研究

安彩霞，趙亞楠，李婷婷，王紅娟，普雄明

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830001）

臨床研究表明, 窄譜中波紫外線（Narrow band ultraviolet B，NB-UVB）對(duì)于白癜風(fēng)患者具有較好的臨床療效[1]。但其作用機(jī)制目前尚不完全清楚[2-3]，我們采用體外培養(yǎng)人的黑素細(xì)胞作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行NB-UVB 的照射，觀察照射前后黑素細(xì)胞增殖和黑素合成功能的變化，以此探討窄譜中波紫外線治療白癜風(fēng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 氨甲環(huán)酸粉劑：中國(guó)食品藥品檢定研究院；胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin）：美國(guó)Gibco 公司；培養(yǎng)基（M1，M2）、CCK－8 試劑、TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）、L－D0PA（左旋多巴）：美國(guó)Sigma 公司；NB－UVB 紫外線治療儀（9W）：飛利浦公司；倒置相差顯微鏡：日本Nikon；二氧化碳培養(yǎng)箱：上海力申科學(xué)儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad 公司；

1.2 研究方法

1.2.1 正常人黑素細(xì)胞的培養(yǎng) 取正常人包皮皮膚，剪成碎塊后以0.25%胰蛋白酶冷消化12～15 h，胎牛血清終止消化，離心并收集細(xì)胞，M1 培養(yǎng)基培養(yǎng)原代，待出現(xiàn)大量典型梭形黑素細(xì)胞后（約10 d），再行胰酶消化，離心收集黑素細(xì)胞，置于M2 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至3～4 代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑素細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 黑素細(xì)胞增殖的測(cè)定 將傳代細(xì)胞的濃度調(diào)整至5×104個(gè)/孔后加入96 孔培養(yǎng)板。24 h 細(xì)胞貼壁后用不同劑量的NB-UVB 照射（照射劑量根據(jù)照射時(shí)間分為0，20，40，60，80，100 s），設(shè)立非照射陰性對(duì)照組，每一處理因素設(shè)立4 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。于結(jié)束前4 h，加入CCK-8 液50 μL/孔，置酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸收光光度值，細(xì)胞增殖率=（待篩物各濃度平均吸光度值-空白組平均吸光度值）/（對(duì)照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）×100%。

1.2.3 酪氨酸酶活性的測(cè)定 96 孔培養(yǎng)板加入細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/孔的黑素細(xì)胞懸液，24 h 后用不同劑量的NB-UVB 照射，并設(shè)立對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h 后棄去上清液，PBS 洗2 次，每孔加0.1%的TritonX-100 溶液100 μL，振蕩15 min，使細(xì)胞完全破裂，加入0.1%L-DOPA 溶液50 μL/孔，37 ℃反應(yīng)過(guò)夜，于酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處行吸收光光度值測(cè)定，酪氨酸酶活性=酶標(biāo)儀所測(cè)吸光度值/細(xì)胞增殖的吸光度值。

1.2.4 黑素含量的測(cè)定 6 孔培養(yǎng)板加入細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)/孔的黑素細(xì)胞懸液，24 h 后用不同劑量的NB-UVB 照射，并設(shè)立非照射陰性對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)72 h。72 h 后棄上清液，PBS 液沖洗，消化、離心并收集細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；然后PBS洗滌2 次，重新溶解于1 mol/L NaOH 500 μL；80 ℃水浴2 h，轉(zhuǎn)移至96 孔板，設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL；置酶標(biāo)儀于405 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，黑素合成量=各孔吸光度值/各孔細(xì)胞密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 軟件分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞 黑素細(xì)胞具有特殊的樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)，體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞多有2 個(gè)樹(shù)突，呈梭形，見(jiàn)圖1，胞體內(nèi)可見(jiàn)黑素顆粒，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)多巴染色陽(yáng)性，見(jiàn)圖2，證實(shí)為黑素細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)NB-UVB 照射后的黑素細(xì)胞胞體變腫脹，樹(shù)突變短，細(xì)胞數(shù)目較未照射組明顯減少。

圖1 體外培養(yǎng)正常的黑素細(xì)胞（鏡下×40）

圖2 多巴染色的黑素細(xì)胞（鏡下×40）

2.2 NB-UVB 照射對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響 NBUVB 照射對(duì)于體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞增殖具有抑制作用，小劑量20 s 照射其抑制作用與對(duì)照比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40 s 以上照射對(duì)黑素細(xì)胞增殖具有抑制作用且隨著劑量增大抑制作用增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，見(jiàn)表1，經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，NB-UVB 照射劑量與黑素細(xì)胞的增殖具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.784（P<0.05）。

表1 不同劑量NB-UVB 對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響

2.3 不同劑量NB-UVB 照射對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響 與對(duì)照組比較，NB-UVB 照射對(duì)于體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性具有促進(jìn)作用，見(jiàn)表2，當(dāng)NB-UVB 增加到一定劑量后酪氨酸酶活性穩(wěn)定在一定范圍。

表2 不同劑量的NB-UVB 對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

2.4 不同劑量NB-UVB 照射對(duì)正常人黑素細(xì)胞的黑素合成的影響 與對(duì)照組比較，只有40 s 劑量NB-UVB 照射對(duì)于體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞黑素的合成具有促進(jìn)作用，20 s 及60 s、100 s 均無(wú)明顯作用，而80 s 則具有一定促進(jìn)作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 不同劑量NB-UVB 照射對(duì)正常人黑素細(xì)胞的黑素合成的影響

3 討論

中波紫外線（UVB），波長(zhǎng)為290～320 nm，是紫外線生物學(xué)活性中最活躍的部分，對(duì)于人體皮膚影響較大。窄譜中波紫外線是指波長(zhǎng)在310 nm 左右的中波紫外線，由于其單一性強(qiáng)，能夠透過(guò)真皮并能在不導(dǎo)致皮膚灼傷的情況下釋放出更多的能量，因此得以廣泛應(yīng)用于皮膚病的治療。臨床研究證實(shí)窄譜中波紫外線對(duì)于白癜風(fēng)患者的治療療效較好，可以有效促進(jìn)色素生成[4-5]，但對(duì)于其作用機(jī)制尚不明確。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，窄譜中波紫外線照射對(duì)于人培養(yǎng)純黑素細(xì)胞增殖具有抑制作用，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，而且其抑制率與紫外線的劑量呈正相關(guān)，這或許提示NB-UVB 治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制或與其他因素有關(guān)。我們分析這種對(duì)體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞增殖的抑制作用符合紫外線的特性，即NB-UVB 對(duì)黑素細(xì)胞產(chǎn)生了劑量依賴性殺傷效應(yīng)，隨著照射劑量的提高，細(xì)胞凋亡數(shù)量也逐漸增加[6]。目前較多的研究認(rèn)為，若在體外以UVB 照射純培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，其數(shù)量將會(huì)減少[7-8]，僅有少數(shù)研究報(bào)道在黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共同培養(yǎng)的條件下經(jīng)過(guò)UVB 照射后黑素細(xì)胞數(shù)量會(huì)增加[9]，這種結(jié)果的出現(xiàn)或與角質(zhì)細(xì)胞的參與有關(guān)。

紫外線對(duì)于黑素細(xì)胞功能的影響，即對(duì)酪氨酸酶活性的影響和對(duì)黑素合成的影響目前報(bào)道也不盡相同[10-11]。Romero-Graille 等[12]報(bào)道，以7.2 mJ/cm2的UVB 照射體外與角質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，可引起黑素細(xì)胞內(nèi)黑素含量的上升，而其他劑量的UVB 未見(jiàn)對(duì)黑素合成有明顯影響；Abdel-Naser[13]的實(shí)驗(yàn)也表明UVB 對(duì)體外純的黑素細(xì)胞僅在小劑量時(shí)有促進(jìn)黑素合成的作用，而隨著輻射劑量的增加，對(duì)黑素合成未見(jiàn)明顯影響，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果很接近，我們也發(fā)現(xiàn)僅在40 s 劑量時(shí)對(duì)黑素合成有促進(jìn)作用，這或許與紫外線照射能促進(jìn)酪氨酸酶活性增加，而隨著劑量增大，黑素細(xì)胞增殖又受到抑制有關(guān)，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。而多項(xiàng)研究報(bào)道UVB 照射能促進(jìn)黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性增加[14-15]。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，可以觀察到不同劑量的窄譜中波紫外線對(duì)于黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性有不同程度的促進(jìn)作用。這種促進(jìn)作用并不隨著劑量逐漸增加，當(dāng)NB-UVB 增加到一定劑量后酪氨酸酶活性穩(wěn)定在一定范圍，這與之前的研究結(jié)果大致相符。曾有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UVB 誘導(dǎo)產(chǎn)生的黑素細(xì)胞DNA 損傷片段可以激活酪氨酸酶的活性，從而促進(jìn)黑素合成[16]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞膜上具有紫外線（UV）受體，UV 是通過(guò)黑素細(xì)胞膜上的光受體激活第二信使系統(tǒng)中的磷脂酶C 和蛋白激酶C，最終出現(xiàn)ɑ-黑素細(xì)胞刺激素樣（ɑ-melanocyte stimulating hormone，ɑ-MCH)作用[17]。由此可以解釋在黑素細(xì)胞受到NB-UVB 照射，黑素細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制而同時(shí)會(huì)出現(xiàn)酪氨酸酶活性增強(qiáng)的現(xiàn)象，但這種細(xì)胞功能增強(qiáng)并不是隨著照射劑量增加無(wú)限增強(qiáng)的，這也體現(xiàn)了紫外線對(duì)于黑素細(xì)胞生物學(xué)特性影響的復(fù)雜性，而在人體內(nèi)，這一過(guò)程可能會(huì)有更多細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)因素的參與，因此，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去研究和探討窄譜中波紫外線治療白癜風(fēng)的可能機(jī)制。

[1] McCoy J, Goren A, Lotti T. In vitro evaluation of a novel topical cream for vitiligo and psoriasis that selectively delivers NB-UVB therapy when exposed to sunlight[J].Dermatol Ther,2014,27:117-120.

[2] Larsson P, Andersson E, Johansson U, et al. Ultraviolet A and B affect human melanocytes and keratinocytes differently: A study of oxidative alterations and apoptosis[J].Exp Dermatol,2005,14:117-123

[3] Kageyama A,Oka M,Okada T.Down regulation of melanogenesis by phospholipase D2 through ubiquitin Proteasome mediated degradation of tyrosinase[J].J Biol Chem,2004,279:774-780.

[4] Kanwar AJ, Dogra S, Parsad D, et al. Narrow-band UVB for the treatment of vitiligo:an emerging effective and well-tolerated therapy[J].Int J Dermatol,2005,44:57-60．

[5] 邱實(shí),樊奇敏,胡慧麗,等.窄譜中波紫外線治療白癜風(fēng)療效與相關(guān)因素的探討[J].中華皮膚科雜志,2014,47（4）:287-288.

[6] Pavey S,Russell T,Gabrielli B.G2 phase cell cycle arrest in human skin following UV irradiation[J].Oncogene,2001,20:6 103-6 110.

[7] Imokawa G, Kawai M, Mishima Y, et al. Differential analysis of experimental hypermelanosis induced by UVB, UVA and contact dermatitis using a brownish guinea pig model[J].Arch Dermatol Res,1986,278:352-362.

[8] Hachiya A, Kobayashi T, Yoshida H, et al. The paracrine role of stem cell factor/e --kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation[J]. Invest Dennatol,2001,116:578-586．

[9] Archambault M,Yaar M,Gilchrest BA.Keratinocytes and fibroblasts in a human skin equivalent model enhance melanocyte survival and melanin synthesis after ultraviolet irradiation[J]. J Invest Dermatol,1995,104:859-867.

[10] Duval C, Regnier M, Schmidt R. Direct melanogenic response of human melanocytes in mono-culture, in co-culture with keratinocytes and in reconstructed epidermis to UV exposure[J].Pigment Cell Res,2001,14:348-355.

[11] De Leeuw SM,Smit NP,Van Veldhoven M,et al.Melanin content of cultured human melanocytes and UV -induced cytotoxicity[J].Photochem Photobiol,2001,61:106-113.

[12] Romero-Graillet C,Aberdam E,Clement M,et al.Nitric oxide produced by ultraviolet-irradiated keratinocytes stimulates melanogenesis[J].Clin Invest,1997,99:635-642.

[13] Abdel-Naser MB, Krasagakis K, Garbe C, et al. Direct effects on proliferation, antigen expression and melanin synthesis of cultured normal human melanocytes in response to UVB and UVA light[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed,2003,19:122-127.

[14] Imokawa G, Kawai M, Mishima Y, et al. Different analysis of experimental hypermelanosis induced by UVB, UVA and contact dermatitis using a brownish guinea pig model[J].Arch Dermatol Res,1986,278:352-362.

[15] 潘建英,竺逸,張玉彬,等.UVA 與UVB 對(duì)人體黑素細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2009,26（1）:43-45.

[16] Larsson P, Andersson E, Johansson U. Ultraviolet A and B affect human melanocytes and keratinocytes diffirently: As to of oxidative alterations and apoptosis[J].Exp Dennatol,2005,14:117-123.

[17] Casberg CJ, Warenius HM, Friedmann PS. Ultraviolet radiation induced melanogenesis in human melanocytes:effects of modulating protein kinase C[J].Cell Sci,1994,107:2 591-2 597.