白細胞介素-17對人黑素細胞合成黑素功能的影響

楊莉莉，隗祎，楊驥，李明

（1．上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；2．復旦大學附屬中山醫(yī)院，上海 200032）

Th17 是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T 輔助細胞（T helper，Th）亞群，通過分泌細胞因子白細胞介素（IL-17）參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化等多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[1]。白癜風作為一種臨床常見的色素脫失性皮膚病，近年來有越來越多證據(jù)支持T 細胞免疫紊亂是

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品 人黑素原代細胞，從小兒包皮中分離，進行原代培養(yǎng)，純化后獲得，使用第2 代或第3代的細胞進行實驗。本實驗所用小兒包皮全部來源于泌尿外科小兒包皮環(huán)切術后遺棄之包皮標本，小兒年齡<10 歲，無白癜風病史或家族史，所有用于研究的標本均獲得家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑 黑素細胞培養(yǎng)液Medium254 及生長因子HMGS 均購自美國Invitrogen 公司。Triton X-100 PrimeScript RT 逆轉錄試劑盒及SYBR green熒光定量PCR 試劑盒均購自日本TAKARA 公司。重組人IL-17A 細胞因子購自美國R&D 公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司。熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)及酶標儀為美國Bio-Rad 品牌。細胞培養(yǎng)箱為德國Heraeus 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人黑素細胞原代培養(yǎng) 取小兒包皮環(huán)切術后遺棄的包皮組織，用含青鏈雙抗的D-Hank′s 液反復沖洗，眼科剪減去皮下組織及部分真皮，并修剪成2 mm×10 mm 的小條，置無菌瓶中，0.2%分離酶4 ℃消化過夜。棄去消化液，沖洗，眼科鑷輕輕分離真表皮，將表皮放入新的培養(yǎng)皿中并剪碎，加入0.25%的胰酶-EDTA 繼續(xù)消化10 min。終止消化，吸管輕輕吹打成細胞懸液，離心，重懸，細胞計數(shù)，按5×105/mL 密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 換液1 次。原代細胞長滿80%時，以0.25%的胰酶-EDTA 消化傳代，第二代接種時采用胰酶差別消化法去除角質形成細胞。實驗選用第2、3 代黑素細胞。

1.2.2 酪氨酸酶活性檢測 將細胞濃度為3×104個/mL 的黑素細胞懸液按每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，用含0，100，200，400 ng/mL IL-17A 的新鮮培養(yǎng)液換液1 次，每種濃度設3 復孔。48 h 后，棄上清液，以PBS 洗1 次，每孔加1%的Triton X-100 溶液90 μL，迅速置-80 ℃凍存30 min，之后室溫下融化使細胞完全破裂。加入0.1%L-DOPA 溶液100 μL/孔，37 ℃水浴箱中反應2 h。于酶標儀490 nm 波長處測定每孔吸光度。酪氨酸酶活性以[藥物處理組A490/空白對照組A490×100%]表示。

1.2.3 黑素含量檢測 將黑素細胞接種于6 孔板，每孔5×104個細胞，細胞接種24 h 后，分別用含0，100，200，400 ng/mL IL-17A 的新鮮培養(yǎng)液換液1次。48 h 后，去上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1 次，每孔加500 μL 濃度為1 mol/L 的NaOH，置70 ℃水浴2 h 以溶解黑素。將6 孔板中的裂解液轉移至96孔板，每孔100 μL，設3 個復孔，置酶標儀于562 nm波長處檢測吸光度值。用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒繪制蛋白濃度標準曲線，計算各給藥孔黑素含量。黑素含量以[藥物處理組A562/空白對照組A562×100%]表示。

1.2.4 熒光定量PCR 將黑素細胞接種于6 孔板，每孔5×104個細胞，細胞接種24 h 后，分別用400 ng/mL 濃度IL-17A 的新鮮培養(yǎng)液換液1 次。48 h后，去上清，用Trizol、氯仿和異丙醇提取黑素細胞RNA，反轉錄，最后行熒光定量PCR。表1 為本實驗所用引物，均由上海生工生物工程公司合成，實驗步驟參照TAKARA 公司Triton X-100 PrimeScript RT 逆轉錄試劑盒及SYBR green 熒光定量PCR 試劑盒說明書進行。見表1。

表1 熒光定量PCR 實驗使用引物

1.2.5 流式細胞儀測定黑素細胞凋亡率 收集400 ng/mL 濃度IL-17A 作用48 h 后的黑素細胞，冷PBS 洗滌1 次，以1 000 轉/min 離心5 min，棄上清，重懸細胞于100 μL 的標記緩沖液中，調整細胞密度為2×105個/mL；每管分別加入Annexin V 溶液和PI 溶液，混勻后于室溫下避光孵育15 min。最后補Annexin Binding Buffer 至400 μL，以流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。每個樣品檢測1 萬個細胞，用Flowjo 7.6 軟件進行細胞凋亡率分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 定量資料采用均數(shù)±標準差表示，通過單因素方差分析ANOVA 或非參數(shù)檢驗進行組間比較。所有統(tǒng)計分析都在SPSS 15.0 for windows 統(tǒng)計軟件中進行。P<0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黑素細胞原代培養(yǎng) 使用商品化的添加HMGS 的M254 培養(yǎng)液和分離酶-胰酶兩步消化法能從小兒包皮中得到大量高純度的原代黑素細胞，細胞在10 d 左右達到完全純化并顯示出旺盛的增殖活性。原代培養(yǎng)10 d 的黑素細胞，鏡下見黑素細胞為樹突狀細胞，大多數(shù)細胞有2～3 級樹突，胞體內可見黑素顆粒，細胞增殖良好，連接成網(wǎng)，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進行傳代培養(yǎng)，約7～10 d 傳一代。經(jīng)Mart-1 單抗免疫細胞化學染色鑒定為純化的黑素細胞，見圖1。

圖1 原代培養(yǎng)并純化的人黑素細胞

2.2 IL-17A 對黑素細胞酪氨酸酶活性和黑素合成量的影響 中、高濃度的IL-17A 對酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用（P<0.05），且呈濃度依賴性。中、高濃度的IL-17A 對黑素合成量具有一定抑制作用（P<0.05），且呈濃度依賴性。見表2。

表2 IL-17 對人黑素細胞酪氨酸酶活性、黑素合成量的影響

2.3 高濃度IL-17A 對黑素合成關鍵基因mRNA表達的影響 將400 ng/mL 的IL-17A 作用黑素細胞48 h，收集黑素細胞并提取總mRNA，常規(guī)逆轉錄后，行熒光定量PCR 檢測mRNA 表達。結果顯示，400 ng/mL 濃度的IL-17A 對酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白-1 和MITF 基因的mRNA 表達均有一定抑制作用（P<0.05）。該結果提示，IL-17A 可能通過抑制酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白-1 和MITF 基因mRNA 的表達，而影響黑素細胞合成黑素的功能。見圖2。

圖2 IL-17 對黑素細胞合成黑素關鍵基因mRNA 表達的影響

2.4 高濃度IL-17A 誘導黑素細胞凋亡的檢測IL-17A 誘導的黑素細胞凋亡率為（5.42±1.66）%，空白對照組為（5．62±1．42）%，2 組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示高濃度IL-17A 對體外培養(yǎng)的黑素細胞無明顯誘導凋亡的作用。

3 討論

人表皮黑素細胞是一種能合成和分泌黑素的樹突狀細胞。其合成的黑素是決定膚色的重要因素，具有吸收各種可見光和紫外線的能力，對防止紫外線對皮膚的損傷有重要的作用[2]。黑素的合成是一個在多種基因調控下由多種生物酶參與的復雜過程。其中酪氨酸酶基因、酪氨酸酶相關蛋白-1基因、酪氨酸酶相關蛋白-2 基因和MITF 是最關鍵的調控基因，而酪氨酸酶則是黑素合成過程中發(fā)揮關鍵作用的酶。各種原因導致的黑素細胞的酪氨酸酶基因和（或）MITF 基因表達異常、酪氨酸酶活性下降等均能引起黑素合成量下降，從而表現(xiàn)為色素減少性皮膚病。白癜風是色素減少性皮膚病中最常見的一種。目前認為，自身反應性淋巴細胞攻擊自身黑素細胞，導致細胞發(fā)生凋亡或合成黑素的功能下降是引起白癜風的重要原因[3]。

Th17 細胞是近年發(fā)現(xiàn)的新Th 細胞亞群，廣泛參與機體炎癥反應、感染性疾病以及AID 的發(fā)病[4]。Th17 細胞主要分泌IL-17，能刺激多種細胞，如上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等分泌多種細胞因子，從而發(fā)揮廣泛的生物學效應[5]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)進展期白癜風患者外周血中Th17細胞比例及其分泌的促炎癥細胞因子IL-17 水平升高，同時，患者進展期白斑邊緣皮膚中有增多的IL-17+T 細胞浸潤，這些現(xiàn)象提示，Th17 細胞及其分泌的細胞因子IL-17 可能在白癜風患者黑素細胞缺失和（或）功能破壞中發(fā)揮一定作用。本文研究了細胞因子IL-17 在體外對黑素細胞合成黑素功能的影響，以期進一步揭示Th17 細胞在白癜風患者黑素細胞破壞中發(fā)揮的作用。我們發(fā)現(xiàn)，IL-17A 可明顯下調黑素細胞酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白-1 和MITF 基因mRNA 的表達，并抑制酪氨酸酶活性和黑素合成，這提示IL-17A 可通過抑制黑素合成過程中關鍵基因mRNA 的表達而破壞黑素細胞合成黑素的功能。新近的一個研究與我們的研究結果相似，發(fā)現(xiàn)用IL-17 作用于體外培養(yǎng)的黑素細胞后，黑素細胞出現(xiàn)形態(tài)收縮、MITF 及其下游基因表達下調，黑素合成下降等變化[6]。這些研究結果提示，白癜風患者外周血中升高比例的Th17 細胞、血清中濃度升高的細胞因子IL-17 和進展期白斑邊緣浸潤的IL-17+T 細胞可通過抑制表皮黑素細胞的功能而參與了白癜風的發(fā)病。有趣的是，我們在研究中并未發(fā)現(xiàn)IL-17 對體外培養(yǎng)的人黑素細胞具有明顯誘導凋亡的作用，推測Th17 可能并非是引起白癜風患者黑素細胞破壞的主要因素，Th17 活化可能繼發(fā)于CD8+細胞毒性T 淋巴細胞等其他免疫細胞對黑素細胞發(fā)動的自身免疫攻擊，從而加重了黑素細胞的功能破壞，導致皮膚白斑的形成。

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