大黃魚cyp19a/b基因的克隆與表達分析

陳　蕓， 周　鵬， 張子平， 謝芳靖， 蔡明夷，王藝磊

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

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大黃魚cyp19a/b基因的克隆與表達分析

陳蕓， 周鵬， 張子平， 謝芳靖， 蔡明夷，王藝磊

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

[摘要]克隆得到了調(diào)節(jié)雌雄激素平衡的大黃魚cyp19a/b基因,cyp19a基因cDNA全長1805 bp(NCBI登錄號：FJ800566)，其中開放閱讀框1557 bp，編碼518個氨基酸；cyp19b基因cDNA全長2268 bp(NCBI登錄號:FJ800567)，其中開放閱讀框1503 bp，編碼500個氨基酸.熒光定量PCR分析顯示cyp19a基因在性腺中有明顯的表達，且在卵巢中的表達量極顯著且高于精巢；在肌肉、腦、肝臟、腎臟、脾臟等組織器官中基本不表達.而cyp19b基因在腦、脾臟和肝臟中有較高表達，在性腺和其他器官中基本不表達.

[關(guān)鍵詞]cyp19a/b基因；芳香化酶；性腺；表達差異

0引言

大黃魚(Larimichthys crocea)是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，在福建省的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量巨大.但是目前大黃魚每年的產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定，主要是因為其抗病力較差、性成熟偏早等問題困擾養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，極大影響了種魚的種質(zhì)和成魚的質(zhì)量.有研究表明，大黃魚體長生長速度隨年齡增大而遞減并逐漸趨于零，性成熟過程中的體長生長速度顯著降低[1].而在人工養(yǎng)殖大黃魚中，大黃魚體重增長速度以2齡魚生長最快，1齡魚一般50~100 g，2齡則可達300~500 g.因此人工養(yǎng)殖大黃魚以養(yǎng)殖1~2年為最佳養(yǎng)殖期[2].而目前人工養(yǎng)殖大黃魚的性成熟年齡也在1~2齡間，生長期與大黃魚性成熟期的重疊在一定程度上可能會影響大黃魚的體重增長.因此，研究大黃魚性腺發(fā)育及性成熟的分子機制，有助于在生產(chǎn)實踐中篩選出具有優(yōu)良性狀的大黃魚.

芳香化酶P450在脊椎動物的性激素形成中有重要作用.雄激素和雌激素在體內(nèi)相關(guān)酶的作用下可相互轉(zhuǎn)化，兩者的平衡直接影響動物性腺的正常發(fā)育.由cyp19基因編碼的芳香化酶p450是雄激素轉(zhuǎn)化生成雌激素的主要限速酶，是維持上述平衡的關(guān)鍵因子[3].在大部分硬骨魚類中存在兩種芳香化酶，一種是由cyp19a基因編碼的性腺型芳香化酶，該基因主要在卵子的類固醇生成鞘和顆粒細胞層表達；另一種是由cyp19b基因編碼的腦型芳香化酶，該基因主要在腦中表達[3].這兩種酶都可以使雄激素睪酮轉(zhuǎn)化成雌激素17b-雌二醇，內(nèi)源性導(dǎo)致性別逆轉(zhuǎn)[3]，因此推測cyp19基因與魚類的性別分化有關(guān)[3].研究發(fā)現(xiàn)，在黃顙魚中cyp19a基因主要在卵巢中表達[4]；在日本比目魚中的研究表明芳香化酶的低水平表達是精巢發(fā)育所必需的[5-6].用芳香化酶抑制劑可誘導(dǎo)魚類發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，主要是因為該抑制劑抑制了cyp19基因的表達，破壞了雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致雌激素量減少[5-6].目前，相關(guān)研究在大黃魚中還未見報道.

本研究擬克隆大黃魚的cyp19a/b基因，并分析它們在大黃魚不同組織中的表達，研究它們在大黃魚性腺發(fā)育及成熟中可能具有的功能奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1　實驗動物

實驗大黃魚體重500 g左右.取精巢、卵巢、肌肉、端腦、中腦、延腦、下丘腦、肝臟、腎臟、脾臟、前腎等組織，提取總RNA備用.

1.2　總RNA的抽提及基因全長的獲取

各組織總RNA的提取根據(jù)本實驗室改良的RDP方法[7-8].根據(jù)已知的cyp19a/b 基因的核苷酸序列，設(shè)計正反向引物，擴增獲得cDNA片段，并克隆測序.然后根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計3′和5′RACE所需特異引物GSP1和GSP2，用SMART-RACE法擴增獲得3′和5′端片段.所有獲得的cDNA片段均與pMD18-T質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化成大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，并篩選陽性克隆測序.所有自行設(shè)計的引物(見表1)合成及序列測序均由上海捷瑞生物工程有限公司完成.

1.3　目的基因的生物信息學(xué)分析

本文中核苷酸、氨基酸序列的同源性比對在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行；蛋白質(zhì)分子量和等電點預(yù)測采用pl/Mw tool；信號肽查找在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/進行；跨膜區(qū)查找采用TMHMM-2.0；磷酸化位點查找采用NetPhos2.0 Server；糖基化位點查找采用NetNGlyc 1.0 Serve；氨基酸結(jié)構(gòu)域分析采用InterProScan；系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用MEGA4.

1.4　熒光定量PCR分析目的基因在各器官的表達

根據(jù)拼接的cyp19a/b的全長cDNA序列，設(shè)計cyp19a、cyp19b、β-actin基因的熒光定量PCR引物(見表1).以cDNA第一條鏈為模板，β-actin為內(nèi)標基因，各基因特異性引物和SYBR Green進行定量PCR擴增.每個反應(yīng)的體系如下：10 μL SYBR Green Real time PCR Master Mix，0.5 μL正向、反向基因特異引物，1 μL cDNA第一條鏈及8 μL無RNase水.反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 min后，進行如下40個循環(huán)：95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min.雌雄大黃魚的每種器官各4個樣品，每個樣品進行3次重復(fù).用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對樣本進行one way ANOVA方差分析，以P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平.

表1　實驗中所用的引物

2結(jié)果與分析

2.1　cyp19a基因序列特征

cyp19a基因cDNA序列全長1805 bp(見圖1，NCBI登錄號：FJ800566)，其中3′UTR(去除polyA部分)長229 bp，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長1557 bp.cyp19a cDNA可編碼518個氨基酸，預(yù)測其分子質(zhì)量約為58.7 ku，等電點約為6.68.該序列在T59-D60有一個信號肽酶切位點，在V32-A55和S67-A90位置分別具有一個由23個氨基酸組成的跨膜區(qū).磷酸化位點(Phosphorylation sites)分析顯示有9個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，3個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和3個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點；糖基化位點(N-x-S/T)在N145區(qū)域.進一步用InterProScan分析發(fā)現(xiàn)cyp19a有一個半胱氨酸鐵-血紅素配體特征區(qū)序列，即[FW]-[SGNH]-x--{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD] (此序列位于442-451氨基酸之間，為FGSGPRSCVG)，該區(qū)是對芳香化酶活性起關(guān)鍵作用的保守區(qū)Ⅲ(血紅素結(jié)合區(qū)).此外，對芳香化酶活性起關(guān)鍵作用的保守區(qū)Ⅰ(Ⅰ-螺旋區(qū))、Ⅱ(P450arom特異保守區(qū))也被發(fā)現(xiàn).

2.2　cyp19b基因序列特征

cyp19b基因cDNA序列全長2268bp(NCBI:FJ800567) (見圖2).其中3′UTR(去除polyA部分)長748bp；ORF長1503bp.

cyp19bcDNA編碼500個氨基酸，預(yù)測其分子質(zhì)量約為56.7ku，等電點約為7.12.該序列在S36-R37有一個信號肽酶切位點.在Q10-F32和G45-G67區(qū)域分別有一個由22個氨基酸組成的跨膜區(qū).磷酸化位點預(yù)測顯示有7個絲氨酸磷酸化位點，4個蘇氨酸磷酸化位點和3個酪氨磷酸化位點；糖基化位點預(yù)測顯示有兩個位點分別是在N9和N39.與cyp19a類似，與芳香化酶活性有關(guān)的保守區(qū)I、II、III(位于426-435氨基酸之間，為FGCGPCSCVG)均被發(fā)現(xiàn).

2.3　cyp19a同源性分析

本文選作同源性比對的GenBank上已注冊的cyp19a氨基酸序列有：

大黃魚(Larimichthyscrocea)ACO35041.1、真鯛(Pagrusmajor)BAB82524.1

點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)AAR97601.1、平鯛(Rhabdosargussarba)ABC70869.1

金頭鯛(Sparusaurata)AAL27699.1、細須石首魚(Micropogoniasundulatus)ABA26927.1

日本擬隆頭魚(Pseudolabrusjaponicus)ABB96485.1、鯔魚(Mugilcephalus)AAW72732.1

花溪鳉(Kryptolebiasmarmoratus)ABC68614.1、鱈魚(Gadusmorhua)ADM15036.1

青鳉(Oryziaslatipes)Q92087.1、綠鰭馬面鲀(Thamnaconusseptentrionalis)AFM35729.1

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)1806325A、細棘海豬魚(Halichoerestenuispinis)AAR37048.1

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)BAJ19136.1、金魚(Carassiusauratus)AAC14013.1

鯉魚(Cyprinuscarpio)ACB13197.1、斑馬魚(Daniorerio)AAK00643.1

雞(Gallusgallus)NP_001001761.1、大鼠(Rattusnorvegicus)NP_058781.2

人(Homosapiens)P11511.3.

結(jié)果表明，大黃魚cyp19a的氨基酸序列與其他魚類的氨基酸序列同源性較高.其與細須石首魚的同源性為96%；與點帶石斑魚的同源性為95%；與真鯛、斑馬魚、金魚的同源性分別是94%、80%和80%；與非洲爪蟾和人類的同源性分別是74%和49%.

2.4　cyp19b基因同源性分析

同源性比對選用GenBank上已注冊的cyp19b的氨基酸序列有：

大黃魚ACO35042.1、平鯛ABC70868.1、日本擬隆頭魚ABB96486.1、鯉魚ACB13198.1

細棘海豬魚AAR37047.1、大西洋庸鰈(Hippoglossushippoglossus)Q4VC53

三星攀鱸(Trichogastertrichopterus)ABR66863.1、鯔魚AAW72730.1、金魚AAB39408.1

底鳉(Fundulusheteroclitus)AAS76199.1、花溪鳉ABC68613.1、斑馬魚AAV41033.1

虹鱒魚cyp19b-ICAC84574.1、虹鱒魚cyp19b-IICAC84575.1、南方鲇AAP83132.1

雞AAA48738.1、家鼠(Mus musculus)BAA00551.1、人 :P11511.3.

結(jié)果表明，大黃魚cyp19b氨基酸序列與平鯛同源性最高，為86%；與大西洋鳙鰈、鯔魚、斑馬魚、金魚的同源性分別是85%、81%、65%和65%；與家鼠、人的同源性分別只有51%、17%.

2.5　cyp19a/b基因在大黃魚各器官中的表達

大黃魚cyp19a/b基因在各器官的表達情況見圖3、圖4.

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，cyp19a在卵巢中表達量最高，顯著高于精巢.該基因在雌雄肝臟、肌肉、端腦，以及雌性脾臟中表達量比較低，而在其他各器官基本不表達.大黃魚cyp19b在中腦、端腦、下丘腦、脾臟和肝臟中有較高表達量，在性腺和其他器官中基本不表達.

2.6　cyp19a/b基因系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA4.0軟件，以鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖5).

3討論

在哺乳動物中只有一種芳香化酶，該酶通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用，影響動物的神經(jīng)內(nèi)分泌、繁殖及性行為[9-10]，并參與調(diào)控哺乳動物性腺的分化[11].在硬骨魚類中，目前發(fā)現(xiàn)金魚由一個cyp19基因編碼腦芳香化酶；而斑馬魚由兩個基因cyp19(cyp19a/b)編碼芳香化酶[12]；虹鱒中則發(fā)現(xiàn)有兩種類型的P450aromB，可能由一個或兩個cyp19基因編碼[13].部分魚類中cyp19a基因在卵子發(fā)生期間的卵黃卵泡中有表達，這與魚類卵巢發(fā)育期間對雌激素的需求相一致；而在腦部，雄激素芳香化變成雌激素是調(diào)節(jié)生理和行為的一個基本步驟，此時cyp19b基因的正常表達至關(guān)重要[14-15].

Chiang[16]研究認為斑馬魚cyp19a基因在卵黃發(fā)生期間主要在濾泡中表達，其功能可能是參與卵巢中卵泡形成過程的卵黃發(fā)生，cyp19b主要在丘腦下部、端腦、嗅球中表達，對神經(jīng)系統(tǒng)的功能、性行為、性別決定產(chǎn)生影響.本研究中大黃魚cyp19a基因主要在性腺中表達，在腦部基本沒有表達(見圖2)；cyp19b主要在腦部(中腦、端腦、下丘腦)、脾臟、肝臟表達，在性腺中基本沒有表達(見圖3)，這與斑馬魚、金魚的研究結(jié)果相似[16-17].對虹鱒[14]、石斑魚[18]的研究表明cyp19b主要在腦和垂體中表達，有明顯的雌、雄差異；cyp19a主要在性腺和垂體表達，且性腺表達量遠高于垂體，無雌雄差異.另外不同魚類的cyp19a/b在脾臟、腎臟、肝臟、腮中有時也有表達，但可能研究魚的種類、年齡、所處發(fā)育狀態(tài)及研究方法不同，表達模式各有不同[11,14，18-19].但一致的是cyp19a和cyp19b在性腺和腦的表達存在明顯的組織特異性[20].斑馬魚中有兩種芳香化酶氨基酸具有60%的同源性，編碼它們的兩個基因是直系同源基因，由同一祖先基因復(fù)制而產(chǎn)生[16].根據(jù)復(fù)制—退化—互補模型[21]，如果基因被相互退化的基本的組織特異性調(diào)控因子所調(diào)節(jié)，兩個復(fù)制的基因的功能都會被保留下來.因此，腦型的cyp19b不能補償卵巢型cyp19a的功能，雌性如果缺乏卵巢型cyp19a就會不育，這在人類和小鼠中已經(jīng)被證實[22-23].本研究中大黃魚兩種芳香化酶的氨基酸同源性達63%，進一步同源比較發(fā)現(xiàn)，大黃魚芳香化酶氨基酸序列與鱸形目魚類相似性高達85%以上，與鯉形目、鯰形目相似性高達65%以上(見圖4).這表明大黃魚兩種芳香化酶基因在進化上保守性較高，但在功能上卻又各自獨立，不可互相替代.cyp19a 和cyp19b表達模式的不同表明它們具有不同的生理功能，也說明在進化過程中這兩個基因在兩種不同組織中的重要性.

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(責(zé)任編輯朱雪蓮英文審校張子平)

Cloning and Expression ofcyp19a/b Gene inLarge Yellow Croaker Larimichthys croceaCHEN Yun， ZHOU Peng， ZHANG Zi-ping，XIE Fang-jing， CAI Ming-yi， WANG Yi-lei

(Fisheries College,Jimei University,Xiamen 361021,China)

Abstract:Gonad development is dependent on balance between estrogen and androgen,which is regulated by expression of the cyp19 gene and its product aromatase cytochrome P450.Two cyp19 genes named as cyp19a and cyp19b have been identified in fish. In this study,both the cyp19a and cyp19b have been cloned from Larimichthys crocea.The cDNA of cyp19a gene is 1805bp in length (NCBI：FJ800566),including the 1557bp open reading frame (ORF) which codes a polypeptide of 518 amino-acid.The cDNA of cyp19b gene is 2268bp in length (NCBI:FJ800567),including the 1503bp ORF which codes a polypeptide of 500 amino-acid.Real-time PCR results show that the expression level of cyp19a in ovary is significantly higher than in testis.And the expression level of cyp19a in gonad is higher than other tissues.The expression level of cyp19b gene in brain,spleen and liver is higher than in gonad,muscle,and kidney.

Key words:cyp19a/b gene；aromatase；gonad；gene expression

[文獻標志碼]A

[中圖分類號]Q 343.1+5

[文章編號]1007-7405(2015)02-0081-09

[作者簡介]陳蕓(1978—)，女，講師，博士，主要從事分子遺傳學(xué)研究.通訊作者：王藝磊(1963—)，女，教授，博士，E-mail：ylwang@jmu.edu.cn.

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(31272653)；福建省自然科學(xué)基金資助項目(2011J05082)；集美大學(xué)創(chuàng)新團隊基金資助項目(2010A001)

[收稿日期]2014-03-10[修回日期]2014-06-26