三黃片對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞間黏附分子1及血管細(xì)胞間黏附分子1表達(dá)的影響

田風(fēng)勝，李　娟,王　霞，王　佟，崔榮崗，邊　云，蘇　陽(yáng)

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 a.內(nèi)分泌科，b.心血管內(nèi)科，河北 滄州 061001； 2.滄州高等醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校，河北 滄州 061001)

三黃片對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞間黏附分子1及血管細(xì)胞間黏附分子1表達(dá)的影響

田風(fēng)勝1a※，李娟1a,王霞2，王佟1b，崔榮崗1a，邊云1a，蘇陽(yáng)1a

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 a.內(nèi)分泌科，b.心血管內(nèi)科，河北 滄州 061001； 2.滄州高等醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校，河北 滄州 061001)

摘要：目的探討三黃片對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)及血管細(xì)胞間黏附分子1(VCAM1)表達(dá)的影響。方法制備糖尿病大鼠模型，成模后，用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法抽取20只分為模型組(10只)和三黃片組(10只)，并設(shè)立正常組(10只)。三黃片組給予三黃片10 g/kg灌胃，其余兩組每日給予同等劑量純凈水灌胃。8周后，取腎臟制備病理切片，鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法免疫組織化學(xué)染色，觀察ICAM1及VCAM1的陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果正常組大鼠腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量分別為(1.79±0.20) g和(3.81±0.49)×10-3，模型對(duì)照組大鼠腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量分別為(2.29±0.27) g和(8.35±0.68)×10-3，三黃片組大鼠腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量分別為(2.01± 0.14) g和(6.08±0.69)×10-3。模型對(duì)照組及三黃片組大鼠腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組大鼠腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)。正常組大鼠尿素氮和肌酐為(7.09±1.03) mmol/L、(42±6) μmol/L，模型對(duì)照組大鼠尿素氮和肌酐分別為(10.14±1.13) mmol/L、(56±8) μmol/L，三黃片組大鼠尿素氮和肌酐為(9.33±1.08) mmol/L、(49±7) μmol/L。模型對(duì)照組和三黃片組大鼠較正常組大鼠尿素氮和肌酐顯著升高(P<0.05)。結(jié)論三黃片能明顯抑制糖尿病大鼠腎臟ICAM-1及VCAM1表達(dá)，具有保護(hù)糖尿病大鼠腎臟的作用。

關(guān)鍵詞:糖尿病模型；三黃片；腎臟

黏附因子屬于一種調(diào)節(jié)細(xì)胞間、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合和識(shí)別的分子，最近幾年以來(lái)，很多研究顯示，細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)以及血管細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,VCAM1)在糖尿病腎病中作為一類(lèi)炎性因子的作用非常大[1-2]，所以，對(duì)于糖尿病腎病患者黏附分子的改變以及表達(dá)產(chǎn)生的因素、影響因素和通過(guò)降低黏附分子藥物針對(duì)緩解疾病的研究非常重要。既往曾研究報(bào)道了清熱類(lèi)中藥大黃具有抗糖尿病大鼠動(dòng)脈硬化的作用[3]，且具有保護(hù)糖尿病大鼠腎臟的作用[4]。本研究就三黃片對(duì)糖尿病大鼠腎臟ICAM1和VCAM1表達(dá)的影響進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1模型與分組40只體質(zhì)量180～220 g健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：1405034)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取30只按文獻(xiàn)方法[5-6]，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg/kg(鏈脲佐菌素臨用前用0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液配成濃度為1%、 pH=4.2的溶液)，72 h后尾靜脈取血，測(cè)血糖≥16.7 mmol/L，確定為糖尿病大鼠。剩余10只健康雄性清潔級(jí)SD大鼠設(shè)為正常組，腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。糖尿病大鼠隨機(jī)抽樣分為模型組10只和三黃片組(哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司,批號(hào)：黑F2010008524)10只。

1.2方法

1.2.1生化指標(biāo)三黃片組給予10 g/kg灌胃，其余兩組每日給予同等劑量純凈水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由進(jìn)食水，持續(xù)給藥8周，禁食12 h測(cè)定各組大鼠的體質(zhì)量后，以3%戊巴比妥(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血測(cè)定血漿尿素氮、肌酐及血糖。

1.2.2腎臟免疫組織化學(xué)摘取大鼠腎臟，去除腎臟包膜吸干水分并用電子分析天平稱(chēng)重，計(jì)算腎臟與體質(zhì)量比值，然后以4%多聚甲醛固定，制備病理切片，鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)計(jì)算病理切片組織中陽(yáng)性染色面積與視窗面積的百分比。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況的變化8周后，模型對(duì)照組1只死于繼發(fā)性腹部感染(可能為腹部注射鏈脲佐菌素時(shí)導(dǎo)致)，三黃片組死亡1只，死因不詳。糖尿病大鼠毛色枯黃，體質(zhì)量下降，飲水、進(jìn)食增多，大便軟，但無(wú)稀水樣便大鼠出現(xiàn)，正常組大鼠無(wú)以上情況的變化。

2.2觀察指標(biāo)的變化模型對(duì)照組和三黃片組大鼠體質(zhì)量顯著低于正常組(P<0.05)，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量顯著低于三黃片組(P<0.05)；正常組大鼠8周后體質(zhì)量較前顯著增高(P<0.05)，模型對(duì)照組和三黃片組大鼠體質(zhì)量較前顯著降低(P<0.05)。模型對(duì)照組和三黃片組大鼠較正常組大鼠腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，三黃片組較模型對(duì)照組大鼠腎質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。模型對(duì)照組和三黃片組大鼠尿素氮及肌酐顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組與模型對(duì)照組尿素氮及肌酐比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療前及治療后，模型對(duì)照組及三黃片組大鼠血糖顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組與模型對(duì)照組血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組治療前后血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表 1。

表1　各組大鼠一般情況的變化　±s)

a與正常組比較,P<0.05；b與模型對(duì)照組比較,P<0.05

2.3腎臟ICAM1及VCAM1的表達(dá)正常組ICAM1、VCAM1微弱表達(dá)，較少的棕黃色顆粒狀陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)(1a，2a)，模型對(duì)照組ICAM1、VCAM1強(qiáng)表達(dá)，可見(jiàn)大量的棕黃色顆粒狀陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)，部分融合成片(圖1b及圖2b)，三黃片組ICAM1、VCAM1中等表達(dá)，棕黃色顆粒狀陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)顯著低于模型對(duì)照組，但高于正常組(圖1c、圖2c)。見(jiàn)圖1、2。模型對(duì)照組、三黃片組的ICAM1、VCAM1均顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組ICAM1、VCAM1顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

1a：正常組; 1b：模型對(duì)照組; 1c:三黃片組

圖1各組腎臟腎臟細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)(蘇木精-伊紅染色×400)

2a：正常組; 2b：模型對(duì)照組; 2c:三黃片組

ICAM1:腎臟細(xì)胞間黏附分子1；VCAM1：血管細(xì)胞間黏附分子1；a與正常組比較，P<0.05；b與模型對(duì)照組比較，P<0.05

3討論

隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，其在患病后5～10年，糖尿病腎病的發(fā)生率為60%～70%，是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的主要原因[7]。據(jù)報(bào)道，在終末期腎病中DN占首位約36%，是糖尿病致死的主要原因之一[8]。由于現(xiàn)在人口老齡化不斷增加，人們的生活方式隨之發(fā)生變化，糖尿病的發(fā)病率不斷升高，已經(jīng)成為很多發(fā)達(dá)國(guó)家在腫瘤以及心腦血管疾病之后的又一大傳染病，糖尿病和并發(fā)癥對(duì)于人們的身體健康造成了很大的危害，糖尿病腎病屬于糖尿病中非常嚴(yán)重的一類(lèi)微血管并發(fā)癥，也是造成糖尿病患者出現(xiàn)死亡的重要因素。美國(guó)糖尿病腎病已經(jīng)超出高血壓腎硬化，屬于終末期腎病的最重要因素。糖尿病腎病的病理學(xué)特點(diǎn)為患者的腎臟體積出現(xiàn)增大，腎小管以及腎小球基膜出現(xiàn)增厚，系膜區(qū)的細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)進(jìn)行性積聚，小管間質(zhì)出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象，主要臨床表現(xiàn)為患者的動(dòng)脈血壓增加，持續(xù)蛋白尿現(xiàn)象，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，主要發(fā)病機(jī)制現(xiàn)在還不是非常清楚，主要認(rèn)為發(fā)病機(jī)制是：磷脂肌醇信號(hào)途徑激活現(xiàn)象、血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生異常、腎小球?yàn)V過(guò)屏障以及蛋白質(zhì)非酶糖基化。有相關(guān)資料顯示，糖尿病腎病一般出現(xiàn)炎性介質(zhì)水平升高、炎性細(xì)胞以及細(xì)胞因子升高，所以，炎癥在糖尿病腎損害中具有非常重要的意義。糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展主要由于高血糖導(dǎo)致腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變以及代謝異常引致腎臟損害，其中代謝異常導(dǎo)致腎臟損害的機(jī)制主要包括[9-12]：①非酶糖基化形成糖基化終末代謝產(chǎn)物的因素；②多元醇通路的激活；③二?；视?蛋白激酶C途徑的激活；④已糖胺通路代謝異常。有研究表明，炎性因子的激活參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展，如胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、ICAM1 及VCAM1等[1-2]。它們促進(jìn)腎小球基膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)蓄積和腎小管間質(zhì)纖維化。ICAM1、VCAM1屬于免疫球蛋白超家族成員，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等，可促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。細(xì)胞黏附出現(xiàn)在細(xì)胞和細(xì)胞之間，或者是細(xì)胞和胞外基質(zhì)之間，保持完整的組織結(jié)構(gòu)以及一些功能，例如炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)生以及器官形成。同類(lèi)細(xì)胞之間的黏附屬于同質(zhì)性黏附，不同類(lèi)細(xì)胞之間的黏附屬于異質(zhì)性黏附，倘若出現(xiàn)黏附的兩分子一樣屬于同嗜性黏附，兩分子不一樣屬于異嗜性黏附。黏附分子屬于一類(lèi)存在于細(xì)胞和細(xì)胞間，細(xì)胞和基質(zhì)間黏附的糖蛋白，可以參與到細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、識(shí)別以及細(xì)胞遷移等過(guò)程，進(jìn)行細(xì)胞黏附的細(xì)胞黏附分子主要包括：鈣黏附素，屬于單鏈跨膜糖蛋白；整合素，幾乎在所有的細(xì)胞膜中存在，主要介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)間的黏附；免疫球蛋白超基因家族，屬于單鏈跨膜蛋白；選擇素，屬于單鏈跨膜蛋白，胞外存在表皮生長(zhǎng)因子和植物凝集素樣的結(jié)構(gòu)；淋巴細(xì)胞膜蛋白，屬于透明質(zhì)酸以及膠原的受體，可以和淋巴組織高內(nèi)皮靜脈中的內(nèi)皮細(xì)胞相互結(jié)合，將淋巴細(xì)胞引導(dǎo)歸巢。ICAM1及VCAM1的過(guò)度表達(dá)，在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越得到人們的認(rèn)識(shí)。Sugimoto等[13]用間接免疫熒光測(cè)定糖尿病鼠特異性ICAM1抗體，發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠的腎小球，特別是腎小球內(nèi)皮和系膜上ICAM1表達(dá)增加，其增加水平和腎小球內(nèi)單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度相平行。林輝等[14]研究亦表明，在糖尿病大鼠腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞均可以見(jiàn)到ICAM1的表達(dá)，而正常大鼠未見(jiàn)表達(dá)；提示ICAM1可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的黏附而參與了糖尿病腎病的病理生理過(guò)程；且腎小球內(nèi)ICAM1的水平與蛋白尿有關(guān)。王汝霞等[15]研究表明，ICAM1及VCAM1均在糖尿病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞系膜細(xì)胞呈高表達(dá)，且這種高表達(dá)可以被甘糖酯所抑制；其研究還表明糖尿病大鼠腎小球內(nèi)ICAM1及 VCAM1水平與蛋白尿有關(guān)。楊俊偉等[16]研究表明，大黃可以下調(diào)腎小球內(nèi)多肽生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而起到抑制糖尿病大鼠早期腎臟肥大的作用。黃翠玲等[17]研究表明，大黃能抑制糖尿病大鼠腎臟肥大，使腎質(zhì)量/體質(zhì)量值明顯下降，降低血尿素氮和肌酐水平，使果糖胺及糖化珠蛋白含量明顯下降，表明大黃對(duì)糖尿病腎臟組織糖基化產(chǎn)物的形成有抑制作用，而達(dá)到保護(hù)腎臟的作用。

本研究結(jié)果顯示，三黃片可以有效抑制糖尿病大鼠體質(zhì)量下降、腎臟腫大、腎質(zhì)量/體質(zhì)量增加的趨勢(shì)；三黃片亦能抑制糖尿病大鼠尿素氮、肌酐的升高，但作用不明顯；同時(shí)研究顯示，三黃片可以明顯抑制腎臟組織ICAM1及VCAM1的表達(dá)，此結(jié)果表明，ICAM1及VCAM1在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。三黃片可能通過(guò)抑制腎臟組織ICAM1及VCAM1的表達(dá)起到保護(hù)效應(yīng)，而非通過(guò)降糖起作用，此結(jié)果與既往研究清熱類(lèi)中藥大黃結(jié)果類(lèi)似，提示清熱類(lèi)中藥具有相似的作用機(jī)制。

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Influence of Sanhuang Tablets on Renal Expression of Intercellular Adhesion Molecule-1 and Vascular Cell Adhesion Molecule-1 in Diabetes Mellitus Rats

TIANFeng-sheng1a,LIJuan1a,WANGXia2,WANGTong1b,CUIRong-gang1a,BIANYun1a,SUYang1a.

(1a.DepartmentofEndocrinology,1b.DepartmentofCardiovascularInternalMedicine,AffiliatedCangzhouTraditional-westernCombinationMedicalHospitalofHebeiMedicalUniversity,Cangzhou061001,China; 2.CangzhouMedicalCollegeofHebeiProvince,Cangzhou061001,China)

Abstract:ObjectiveTo explore influence of Sanhuang tablets on renal expression of intercellular adhesion molecule 1(ICAM1) and vascular cellular adhesion molecule 1(VCAM-1) in diabetes mellitus(DM) rats.MethodsThe DM rat model was made.20 rats were randomly selected and divided into model group(10 rats) and Sanhuang group(10 rats),and a normal control group(10 rats) was set up.Sanhuang tablets were given to the Sanhuang group,by 10 g/kg,gavage;the other two groups were given the same amount of pure water,gavage.8 weeks later,kidneys were removed and the pathologic slices were prepared to observed the expression of ICAM-1 and VCAM-1 by streptavidin-perosidase(SP) immunohistochemical staining.ResultsKidney weight and kidney weight/body weight ratio of the normal control group were(1.79±0.20) g,(3.81±0.49)×10-3,of the model group were (2.29±0.27) g,(8.35±0.68)×10-3,of Sanhuang group were (2.01± 0.14) g，(6.08±0.69)×10-3.Model group and Sanhuang group were significantly higher than the normal control group (P<0.05),and the Sanhuang group lower than the model group(P<0.05).Blood urea nitrogen and creatinine of the normal control group were (7.09±1.03) mmol/L,(42±6) μmol/L,of the model group were (10.14±1.13) mmol/L,(56±8) μmol/L,of the Sanhuang group were (9.33±1.08) mmol/L,(49±7) μmol/L.The model group and Sanhuang group were significantly increased than the normal control group(P<0.05).ConclusionSanhuang tablets can inhibit the expression of ICAM-1 and VCAM-1 and protect kidney of the diabetic rats.

Key words:Diabetic model; Sanhuang tablets; Kidney

收稿日期：2015-06-24修回日期：2015-08-28編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.042

中圖分類(lèi)號(hào)：R589.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)23-4340-04