前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

蘇曉娜，李高偉，張培熾，王　閣(綜述)，王　東※(審校)

(1. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042； 2.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院腫瘤科，重慶 400700)

前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

蘇曉娜1，李高偉2，張培熾1，王閣1(綜述)，王東1※(審校)

(1. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042； 2.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院腫瘤科，重慶 400700)

摘要：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。CTCs的臨床應(yīng)用對(duì)實(shí)體惡性腫瘤的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和療效觀察提供了一種無創(chuàng)性新方法。盡管前列腺癌的具體病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但CTCs作為患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，在前列腺癌的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)個(gè)體化治療中具有重要的臨床意義。

關(guān)鍵詞：前列腺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；檢測(cè)方法

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌發(fā)病率居全球男性惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌，是威脅男性健康和生命的重要惡性疾病之一[1]。前列腺癌的發(fā)病是多因素相互作用的復(fù)雜過程，目前尚缺乏有效的預(yù)防方法，術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2-3]。高特異性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)及高敏感性的檢測(cè)方法對(duì)患者術(shù)后療效及復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)具有重要意義。研究證實(shí)，前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)密切相關(guān)[4-5]。通過檢測(cè)CTCs不僅有助于正確評(píng)估病情，而且治療期間連續(xù)監(jiān)測(cè)CTCs的變化水平還可及時(shí)、準(zhǔn)確地反映治療效果，判斷治療方案的敏感性。現(xiàn)就前列腺癌CTCs研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1CTCs的檢測(cè)

血液中CTCs 數(shù)目極少，約每10億個(gè)正常血細(xì)胞中才會(huì)發(fā)現(xiàn)1個(gè)，常規(guī)的血清學(xué)、影像學(xué)及病理學(xué)等檢查方法很難檢測(cè)到[6]。骨髓檢測(cè)相對(duì)容易得到標(biāo)本，但屬于有創(chuàng)操作，臨床連續(xù)檢測(cè)可重復(fù)性不高。由于外周血含量極低，因此在進(jìn)行檢測(cè)和生物學(xué)分析前首先應(yīng)對(duì)血樣中CTCs進(jìn)行富集，以提高檢測(cè)的靈敏度。

1.1CTCs分離富集方法 CTCs的臨床和生物學(xué)應(yīng)用很大程度上依賴于所使用的分離技術(shù)。不同方法在敏感性和分離效率等方面存在差異，加之CTCs的異質(zhì)性，不同技術(shù)往往能分離出不同細(xì)胞亞群，產(chǎn)生不同的生物學(xué)特征。常用的富集方法多基于CTCs的物理特性或免疫磁性。

1.1.1密度梯度分離法 密度梯度分離法主要依據(jù)血液中各細(xì)胞成分的密度不同，經(jīng)過離心后各細(xì)胞成分在細(xì)胞分離液中呈現(xiàn)梯度分布，從而將各種細(xì)胞加以分離。密度梯度分離法的局限性主要是敏感度較低，容易造成缺乏相應(yīng)密度的腫瘤細(xì)胞丟失[7]。

1.1.2膜濾過分離法膜濾過分離腫瘤細(xì)胞主要依據(jù)濾過細(xì)胞的大小進(jìn)行分離，較小的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞可通過微孔濾去，而較大的腫瘤細(xì)胞則被阻滯在膜上。該方法操作簡單，靈敏度較高，可達(dá)1個(gè)腫瘤細(xì)胞/mL外周血[8]。膜濾過分離法不僅可用來計(jì)數(shù)CTCs，還可進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞染色、免疫標(biāo)記、熒光原位雜交等分析，但缺乏特異性，易丟失直徑<8 μm和正發(fā)生溶解的腫瘤細(xì)胞。

1.1.4微流體芯片分離法微流體芯片分離技術(shù)和其改進(jìn)技術(shù)HBCTC-Chip (herringbone-chip)均能檢測(cè)出血液中極微量癌細(xì)胞。CTC-Chip在970 mm2的芯片表層排布了78 000個(gè)包被抗體的微柱定位點(diǎn)，抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合，促使CTCs最大限度黏附于芯片上，血液中白細(xì)胞和紅細(xì)胞則從芯片洗滌清除，然后CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)或用分子特征鑒定的方法進(jìn)行分析。Nagrath等[12]對(duì)來自上皮細(xì)胞腫瘤患者的116份血樣進(jìn)行CTC-Chip檢測(cè)，115份(99%)血樣中檢測(cè)到CTCs，其中7例早期前列腺癌患者血樣中均檢測(cè)到CTCs，具有較高的靈敏度和特異度。該方法無需通過有創(chuàng)手段取得實(shí)體腫瘤組織即可對(duì)病灶進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，因此又被稱為“液體活檢”[13]。

1.2CTCs分析技術(shù)CTCs是從機(jī)體實(shí)體腫瘤上脫落，然后進(jìn)入血液循環(huán)的。分析技術(shù)能夠在400億血細(xì)胞中辨別和計(jì)數(shù)少量的CTCs，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師對(duì)患者的治療決策。通過分析CTCs的系列測(cè)量結(jié)果，結(jié)合其他的臨床監(jiān)測(cè)方式，醫(yī)師就能把握疾病的進(jìn)展，指導(dǎo)患者在掌握更多信息的基礎(chǔ)上更早地進(jìn)行治療。分析技術(shù)主要依據(jù)前列腺CTCs本身的形態(tài)學(xué)特征或腫瘤細(xì)胞表達(dá)的某些特異性標(biāo)志物來檢測(cè)分析CTCs，主要包括免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、光導(dǎo)纖維陣列掃描技術(shù)、激光掃描細(xì)胞計(jì)量技術(shù)等。

1.2.1免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是以顯色劑(熒光素、酶等)標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)與腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物(CK、上皮細(xì)胞膜特異性抗原等)結(jié)合顯色，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定位、定性測(cè)定的技術(shù)。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是CTCs檢測(cè)的重要方法之一，但由于其靈敏度只有105左右，且分化較差的腫瘤細(xì)胞對(duì)目標(biāo)抗原的表達(dá)較弱或不能表達(dá)，均易導(dǎo)致假陰性[14]。這些在一定程度上限制了免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)集激光、電子物理、細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)等為一體的新型技術(shù)。它利用腫瘤細(xì)胞單抗結(jié)合熒光物質(zhì)使腫瘤細(xì)胞染色，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析，染色細(xì)胞被視為陽性。其優(yōu)點(diǎn)主要是可以定量計(jì)算腫瘤細(xì)胞數(shù)目，并且可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，測(cè)量速度較快，但流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞的靈敏度較低，僅為1/104～1/105，而采用免疫磁性分離法首先進(jìn)行富集再進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析則可顯著提高檢測(cè)CTCs的敏感性[15]。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)CTCs是基于組織或腫瘤細(xì)胞某些基因改變后DNA水平異常或特異性信使RNA的表達(dá)來間接測(cè)定CTCs的存在。該方法靈敏度較高，可在107～108個(gè)外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到單個(gè)腫瘤細(xì)胞[16]。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)最重要的缺陷是無法進(jìn)行CTCs計(jì)數(shù)，因此無法實(shí)現(xiàn)CTCs數(shù)目的連續(xù)監(jiān)測(cè)；另外，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)是以腫瘤標(biāo)志物的信使RNA為標(biāo)志物，易受到靶基因在正常細(xì)胞中的表達(dá)、偽基因的擴(kuò)增及操作過程中污染等因素影響。Kowalewska等[17]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可引起腫瘤抗原信使RNA的升高使檢測(cè)出現(xiàn)假陽性，因此提出運(yùn)用多標(biāo)志聯(lián)合檢測(cè)法在一定程度上可彌補(bǔ)由于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性及個(gè)體間表達(dá)差異造成的假陰性或假陽性。

2CTCs的臨床應(yīng)用

2.1CTCs與前列腺癌預(yù)后CTCs在局限性前列腺癌的臨床應(yīng)用中目前仍存在一定爭議，但在進(jìn)展和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床應(yīng)用中得到廣泛認(rèn)可[18]。Okegawa等[19]對(duì)76例激素難治性前列腺癌患者外周血采用CellSearch系統(tǒng)進(jìn)行CTCs檢測(cè)，分析基線CTCs計(jì)數(shù)與患者總生存期的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，基線CTCs計(jì)數(shù)≥5的患者(47例)總生存期為12.0個(gè)月，顯著短于基線CTCs計(jì)數(shù)<5的患者(26.0個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，并且前者的死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯高于后者，可見基線CTCs計(jì)數(shù)可作為總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。Danila等[20]運(yùn)用類似方法對(duì)120例去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者進(jìn)行研究，分析基線CTCs計(jì)數(shù)及化療過程中數(shù)目的變化與總生存期的關(guān)系；研究發(fā)現(xiàn)，99例血樣(82%)中檢測(cè)到CTCs，其中69例血樣(57%)基線CTCs計(jì)數(shù)≥5，且治療前后CTCs計(jì)數(shù)均≥5的患者預(yù)后較差，治療后CTCs計(jì)數(shù)<5的患者有著相對(duì)較好的預(yù)后，說明CTCs計(jì)數(shù)及治療后數(shù)目的變化均是總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。

2.2CTCs與前列腺癌治療監(jiān)測(cè)抗腫瘤治療療效的檢測(cè)是CTCs的臨床重要領(lǐng)域之一，CTCs檢測(cè)可作為影像學(xué)及臨床其他檢查體系的有力補(bǔ)充。通過對(duì)CTCs數(shù)目的監(jiān)測(cè)，不僅能夠準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)腫瘤治療效果、判斷疾病的進(jìn)展，同時(shí)由于其操作簡便、無創(chuàng)，還能對(duì)患者進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，及時(shí)對(duì)治療應(yīng)答作出評(píng)估調(diào)整，CTCs在監(jiān)測(cè)各類惡性腫瘤對(duì)治療方案反應(yīng)的研究中逐漸顯現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。Stott等[21]使用CTC-Chip技術(shù)對(duì)19例局限性前列腺癌患者外周血進(jìn)行CTCs計(jì)數(shù)研究，8例患者檢測(cè)到CTCs，術(shù)后24 h再次檢測(cè)，8例患者中6例CTCs計(jì)數(shù)明顯下降，另外2例患者在術(shù)后3個(gè)月內(nèi)也明顯下降，術(shù)后1年內(nèi)均未檢測(cè)到復(fù)發(fā)。Scher等[22]對(duì)164例去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者進(jìn)行類似研究，發(fā)現(xiàn)大部分患者在治療后CTCs計(jì)數(shù)明顯下降，并且CTCs計(jì)數(shù)變化與生存時(shí)間之間關(guān)系密切。

2.3CTCs作為實(shí)時(shí)“病理標(biāo)本”進(jìn)一步指導(dǎo)個(gè)體化治療隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)前列腺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，前列腺癌分子標(biāo)志物研究也逐漸受到廣泛關(guān)注。目前已知的與前列腺癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素包括雄激素受體基因的擴(kuò)增和突變、跨膜絲氨酸蛋白酶2基因融合、表皮生長因子受體的表達(dá)及人類第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因等[23]。CTCs的檢測(cè)可幫助進(jìn)一步了解腫瘤細(xì)胞的遺傳背景，從而針對(duì)性研究阻斷相應(yīng)受體的藥物，提高治療的針對(duì)性和有效性。晚期前列腺癌患者雄激素受體信號(hào)仍是疾病進(jìn)展的重要途徑。多西他賽是第1個(gè)被證實(shí)能延長晚期前列腺癌患者生存期的雄激素受體抑制類藥物。Galsky和Vogelzang[24]對(duì)接受多西他賽治療的去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者外周血CTCs進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，患者對(duì)多西他賽的敏感性與CTCs中雄激素受體水平相關(guān)，對(duì)化療有效的患者CTCs中雄激素受體水平明顯低于耐藥患者，提示可通過外外周血CTCs中雄激素受體水平來間接預(yù)測(cè)患者對(duì)多西他賽的敏感性。這與Pantel和Alix-Panabieres[13]的研究結(jié)果一致。可見，外周血CTCs檢測(cè)可反映患者對(duì)治療藥物和方案的敏感性，進(jìn)而指導(dǎo)臨床選擇個(gè)體化治療方案。

3小結(jié)

前列腺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移是多因素作用的復(fù)雜過程，CTCs在前列腺癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中起著重要作用，為判斷疾病的預(yù)后及指導(dǎo)個(gè)體化治療提供了新的思路和方法。目前CTCs各種檢測(cè)技術(shù)之間特異性和敏感性不同，各實(shí)驗(yàn)室間又未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)等因素均對(duì)其臨床廣泛應(yīng)用帶來挑戰(zhàn)。因此,進(jìn)一步完善CTCs的臨床研究，探究標(biāo)準(zhǔn)化敏感檢測(cè)方法，可為前列腺癌的早期診斷、療效判斷及指導(dǎo)治療創(chuàng)造新的機(jī)遇。

參考文獻(xiàn)

[1]Ferlay J，Shin HR，Bray F，etal．Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J]．Int J Cancer，2010，127(12):2893-2917．

[2]Pachmann K,Clement JH,Schneider CP,etal.Standardized quantification of circulating peripheral tumor cells from lung and breast cancer[J].Clin Chem Lab Med,2005,43(6):617-627.

[3]Carvalho FL,Simons BW,Antonarakis ES,etal.Tumorigenic potential of circulating prostate tumor cells[J].Oncotarget,2013,4(3):413-421.

[4]Ciesing M,Driesel G,Molitor D,etal.Molecular phenotyping of circulating tumour cells in patients with prostate cancer:prediction of distant metastases[J].BJU Int,2012,110(11 Pt C):E1202-

1211.

[5]Kim MY,Oskarsson T,Acharyya S,etal.Tumor self-seeding by circulating cancer cells[J].Cell,2009,139(7):1315-1326.

[6]Maheswaran S,Haber DA.Circulating tumor cells:a window into cancer biology and metastasis[J].Curr Opin Genet Dev,2010,20(1):96-99.

[7]楊華旺,姚慶祥,劉春雨.前列腺特異性抗原篩查與前列腺癌[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(3):374-376.

[8]Zabaglo L,Ormerod MG,Parton M,etal.Cell filtration-laser scanning cytometry for the characterisation of circulating breast cancer cells[J].Cytometry A,2003,55(2):102-108.

[9]左其明，周占松.前列腺癌腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(24)：4456-4458.

[10]Detchokul S,Frauman AG.Recent developments in prostate cancer biomarker research:therapeutic implications[J].Br J Clin Pharmacol,2011,71(2):157-174.

[11]Hu B,Rochefort H，Goldkorn A.Circulating tumor cells in prostate cancer[J].Cancer,2013,5(4):1676-1690.

[12]Nagrath S,Seguist LV,Maheswaran S,etal.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J].Nature,2007,450(7173):1235-1239.

[13]Pantel K,Alix-Panabieres C.The potential of circulating tumor cells as a liquid biopsy to guide therapy in prostate cancer[J].Cancer Discov,2012,2(11):974-975.

[14]曹璐,徐文,殷正豐.循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離與檢測(cè)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(3):313-316.

[15]Wicha MS，Hayes DF．Circulating tumor cells:not all detected cells are bad and not all bad cells are detected[J]．J Clin Oncol，2011，29(12):1508-1511.

[16]Helo P,Cronin AM,Danila DC,etal.Circulating prostate tumor cells detected by reverse transcription-PCR in men with localized or castration-refractory prostate cancer:concordance with CellSearch assay and association with bone metastases and with survival[J].Clin Chem,2009,55(4):765-773.

[17]Kowalewska M,Chechlińska M,Markowicz S,etal.The relevance of RT-PCR detection of disseminated tumour cells is hampered by the expression of markers regarded as tumour-specific in activated lymphocytes[J].Eur J Cancer,2006,42(16):2671-2674.

[18]Davis JW,Nakanishi H,Kumar VS,etal.Circulating tumor cells in peripheral blood samples from patients with increased serum prostate specific antigen:initial results in early prostate cancer [J].J Urol,2008,179(6):2187-2191.

[19]Okegawa T,Nutahara K,Higashihara E.Association of circulating tumor cells with tumor-related methylated DNA in patients with hormone-refractory prostate cancer[J].Int J Urol,2010,17(5):466-475.

[20]Danila DC,Heller G,Gignac GA,etal.Circulating tumor cell number and prognosis in progressive castration-resistant prostate cancer[J].Clin Cancer Res，2007,13(23):7053-7058.

[21]Stott SL,Lee RJ,Nagrath S,etal.Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer[J].Sci Transl Med，2010，2(25):25ra23.

[22]Scher HI,Jia X,de Bono JS,etal.Circulating tumour cells as prognostic markers in progressive,castration-resistant prostate cancer:a reanalysis of IMMC38 trial data[J].Lancet Oncol，2009，10(3):233-239.

[23]Miyamoto DT,Lee RJ,Stott SL,etal.Androgen receptor signaling in circulating tumor cells as a marker of hormonally responsive prostate cancer[J].Cancer Discov,2012,2(11):995-1003.

[24]Galsky MD，Vogelzang NJ．Docetaxel-based combination therapy for castration-resistant prostate cancer[J]．Ann Oncol,2010,21(11):2135-2144．

Research Progress in the Clinical Application of Circulating Tumor Cell in Prostate Cancer Progression

SUXiao-na1,LIGao-wei2,ZHANGPei-chi1,WANGGe1,WANGDong1.

(1.CancerCenter,DapingHospitalandResearchInstituteofSurgery,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China； 2.DepartmentofOncologyChongqingBeibeiDistrictTCMHospital,Chongqing400700，China)

Abstract：Circulating tumor cells(CTCs) refer to the tumor cells that get into peripheral blood circulation spontaneously or along with some operations for diagnosis and treatment.The clinical application of CTCs provides a non-invasive method for accurate monitoring and clinical observation in prostate cancer.Though the exact pathogen of prostate cancer is unclear,CTCs is an important factor of recurrence and distant metastasis,which has an important clinical significance for early diagnosis,monitoring,prognosis evaluation and guiding individualized treatment.

Key words：Prostate cancer； Circulating tumor cells； Detection methods

收稿日期：2015-06-29修回日期：2015-08-11編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.024

中圖分類號(hào)：R73725

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)23-4291-03