白藜蘆醇-泊洛沙姆188固體分散體的制備及其性能研究

任紅暖，王曉麗，陳肖如，陳麗萍，周婷婷，高振珅，2#，宋興良（.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276005；2.臨沂大學(xué)現(xiàn)代中藥研究所，山東臨沂 276005；3.臨沂大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東臨沂 276005；4.山東省資源與環(huán)境分析化學(xué)重點實驗室，山東臨沂 276005）

白藜蘆醇（RES）是一種非黃酮類多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保護(hù)、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)以及延長低等生物壽命等多種生理活性[1]。RES 在水中的溶解度低，常用乙醇、二甲基亞砜等溶劑溶解，但使用這些溶劑制備的RES 溶液對體外培養(yǎng)的細(xì)胞和對體內(nèi)細(xì)胞都會產(chǎn)生不利的影響。由于RES 溶解度低、生物利用度低、水溶液穩(wěn)定性差，限制了其在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[2]。目前，已有研究報道，將其制成納米粒、包合物、改性葡聚糖結(jié)合物等來提高其溶解度、穩(wěn)定性[2-4]。泊洛沙姆188（P188）是一種非離子型高分子表面活性劑，在藥物制劑中主要用作乳化劑和增溶劑，也是常用的載體材料之一。筆者擬以P188為載體材料，制備白藜蘆醇-P188固體分散體（RES-P188-SD），從而提高RES 的溶解度，改善RES 的溶出性能和抑菌性，達(dá)到增強(qiáng)藥效的目的，以期為RES新制劑的開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TU-1810 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；S3400 掃描電鏡（日本日立公司）；ZRS-8G 釋放儀（天津鑫洲科技有限公司）；DZF-6021真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SW-CJ-2FD 凈化工作臺（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；XFS-280A高壓蒸汽滅菌鍋（上海新豐醫(yī)療器械有限公司）；SPX-400B 生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

RES 原料藥（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號：20141010，純度：＞98%）；RES 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111535-200502，純度：≥98%）；P188（德國Basf 公司，批號：WPMG557C）；其余試劑均為分析純。

1.3 菌種

大腸埃希菌ATCC 29523、金黃色葡萄球菌ATCC 29213由臨沂大學(xué)現(xiàn)代中藥研究所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 RES分析方法的建立

2.1.1 測定波長選擇 取RES 對照品適量，用無水乙醇溶解并制備成適宜質(zhì)量濃度的RES 對照品溶液；按處方比例稱取空白輔料，用無水乙醇制備成適宜質(zhì)量濃度的輔料對照溶液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，在200～500 nm 波長范圍內(nèi)紫外掃描。結(jié)果，RES對照品溶液在305 nm波長處有最大吸收，且輔料在此處無干擾，故選擇305 nm為測定波長。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定干燥至恒質(zhì)量的RES對照品0.01 g，置于100 ml 棕色量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，制備成質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml的RES對照品貯備液。分別量取RES對照品貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于10 ml棕色量瓶中，用無水乙醇稀釋并定容至刻度，制備成質(zhì)量濃度為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/ml 的RES 對照品系列溶液。分別在305 nm 波長處測定吸光度（A），以A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（c，mg/ml）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝0.118 6c－0.017 7（r＝0.999 7，n＝5）。結(jié)果顯示，RES 檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.002～0.010 mg/ml。

2.1.3 精密度試驗 量取質(zhì)量濃度為0.006 mg/ml RES的對照品溶液，在305 nm波長處測定A，同日內(nèi)連續(xù)測定5次，考察日內(nèi)精密度；每日測定1 次，連續(xù)測定5 d，考察日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)和日間精密度的RSD分別為0.14%、0.75%（n＝5），表明該方法精密度良好。

2.1.4 方法回收率試驗 量取對照品貯備液6、8、10 ml，各取3份，共9份，分別置于100 ml量瓶中，按照處方比例精密稱取輔料并分別加入量瓶中，加入5 ml pH為6.8的磷酸鹽緩沖液，再用無水乙醇定容至刻度，搖勻后，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液。于305 nm 波長處測定A，計算方法回收率。結(jié)果，平均回收率為100.5%（RSD＝0.57%，n＝9），表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.2 RES-P188-SD的制備

稱取RES 原料藥1 g 于蒸發(fā)皿中，加無水乙醇適量，使其充分溶解。稱取處方量的P188 于蒸發(fā)皿中，用乙醇溶解并與RES原料藥混合均勻，于恒溫水浴中揮干乙醇，置于60 ℃干燥箱中干燥，粉碎，過80目篩，即得。

2.3 RES和P188物理混合物的制備

按照最佳方案的藥物與載體的質(zhì)量比，分別精密稱取RES原料藥、P188于研缽中，混勻，過80目篩，即得。

2.4 溶解度的測定[5]

取過量的RES 原料藥和RES-P188-SD 分別置于25 ml 具塞三角燒瓶中（避光），分別加入5 ml 蒸餾水，在溫度為（25±1）℃下恒溫振蕩24 h，制成過飽和溶液。待達(dá)到溶解平衡后，取上清液用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，用適量蒸餾水稀釋后，采用紫外吸收法在305 nm波長處測定A，分別計算RES和RES-P188-SD在水中的溶解度。

2.5 溶出度測定

參照2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅩC項下溶出度測定第一法（籃法）測定溶出度[6]。將RES原料藥、RES與P188的物理混合物和RES-P188-SD（相當(dāng)于RES 原料藥15 mg）分別均勻分散于溫度為（37±0.5）℃、體積為900 ml、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別在5、10、15、30、60、90、120 min時通過玻璃管過濾器（0.45 μm微孔濾膜）定位定時吸取10 ml 溶出液（同時補(bǔ)充同溫新鮮緩沖溶液10 ml），濾過。取續(xù)濾液5 ml，置于10 ml棕色量瓶中，放至室溫，適當(dāng)稀釋后，于305 nm波長處測定A，計算累積溶出度。

2.6 單因素試驗考察

2.6.1 熔融溫度的考察 預(yù)試驗中按照RES原料藥與P188的質(zhì)量比為1 ∶2制備RES-P188-SD，蒸發(fā)溶劑的溫度分別設(shè)定在60、70、80、90 ℃。結(jié)果RES 收率（收率＝收得量/投料量×100%）分別為92.15%、89.50%、89.19%、89.82%。60 ℃時熔融時間較長，70 ℃時熔融速度較快，而80 ℃和90 ℃時熔融迅速，隨溫度的升高，熔融用時縮短，收率也有所降低。

2.6.2 藥載比的考察 分別以RES原料藥與P188的質(zhì)量比為1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9，在70 ℃下熔融，制備RES-P188-SD，觀察其性狀并測定收率。結(jié)果顯示，RES-P188-SD 干燥后呈暗黃膠態(tài)，表面泛油光；隨著P188 質(zhì)量的增加，固體分散體干燥的時間越短，干燥的效果越好（不同比例下RES收率分別為68.87%、71.11%、82.80%、88.23%、88.59%）。

2.6.3 篩網(wǎng)目數(shù)的考察 分別以RES原料藥與P188的質(zhì)量比為1 ∶1，在70 ℃下熔融，分別過18 目、40 目、80 目篩，制備RES-P188-SD，測定收率。結(jié)果顯示，收率分別為75.80%、74.23%、73.01%。

2.7 正交試驗設(shè)計

為獲得較優(yōu)的試驗條件，根據(jù)預(yù)試驗及單因素試驗結(jié)果，以藥物RES 與載體P188 質(zhì)量比（A）、熔融溫度（B）、篩孔目數(shù)（C）為考察因素，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗，以RES-P188-SD的溶解度（x）和收率（y）為考察指標(biāo)，以兩者的綜合評分（Z）進(jìn)行結(jié)果分析，優(yōu)選最優(yōu)制備工藝。評分總分為100分，x、y分別為50分（Z＝xi/xmax×50+yi/ymax×50）。因素與水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

通過直觀分析和方差分析可知A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C1＞C3＞C2，各因素對試驗結(jié)果影響的大小順序為C＞A＞B。由此可以得最優(yōu)工藝條件為A3B2C1，即藥物與載體質(zhì)量比為1∶10、熔融溫度為70 ℃、篩孔目數(shù)為80目。

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

2.8 驗證試驗

按最優(yōu)工藝條件制備3 批RES-P188-SD樣品。結(jié)果，3批RES-P188-SD 的溶解度分別為0.51、0.52、0.50 mg/ml，平均溶解度為0.51 mg/ml（RSD＝1.96%，n＝3）；收率分別為91%、90%、91%，平均收率為91%（RSD＝0.64%，n＝3）；15 min 累積溶出度分別為83%、84%、83%，平均累積溶出度為83%（RSD＝0.69%，n＝3），表明優(yōu)化的處方和工藝合理、穩(wěn)定。

2.9 掃描電鏡分析物相表面特征

真空鍍金70 s，用掃描電鏡觀察RES 原料藥、載體材料P188、RES 與P188 的物理混合物以及RES-P188-SD 的表面和晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果，RES 原料藥與RES-P188-SD 的表面結(jié)構(gòu)完全不同，RES 以大小不一的結(jié)晶體存在，P188 以非晶形存在；RES 與P188 的物理混合物為晶體和非晶體的混合物；而RES-P188-SD 中已經(jīng)沒有晶體存在，即表明RES 以非晶形態(tài)均勻分散在載體P188 中，形成了RES-P188-SD。電鏡掃描圖見圖1。

2.10 抑菌試驗[7]

2.10.1 菌懸液的制備 將各試驗菌種（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌）活化后，用生理鹽水制備菌懸液，并用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，制成濃度?08CFU/ml的菌懸液，備用。

2.10.2 藥物分組 將“2.2”項下所制備的RES-P188-SD 用蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度為0.20 mg/ml，作為試驗組；用蒸餾水制備RES原料藥飽和水溶液，取上清液適量（相當(dāng)于質(zhì)量濃度為0.03 mg/ml），作為對照組。121 ℃高壓滅菌20 min，置4 ℃冰箱中貯藏，備用。

圖1 掃描電鏡圖A.RES原料藥；B.P188；C.RES與P188物理混合物；D.RES-P188-SDFig 1 Scanning electron microscopy figuresA.crude resveratrol；B.poloxamer 188；C.physical mixture of resveratrol and poloxamer 188；D.resveratrol-poloxamer 188-solid dispersion

2.10.3 抑菌試驗 采用管碟法將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至55 ℃左右，制備平板。取“2.10.1”項下制備的菌懸液0.3 ml，按“2.10.2”項下分組，用L型玻璃棒均勻涂在平板上，均勻放置3 個牛津杯，每個加入藥物溶液0.2 ml，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h 后，測量抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑（mm）確定敏感性：抑菌圈直徑小于10 mm 為耐藥，10～15 mm 為中度敏感，15 mm 以上為高度敏感[8]。結(jié)果顯示，RES飽和水溶液對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出耐藥（抑菌圈直徑為3 mm），對大腸埃希菌無抑制作用；RES-P188-SD 水溶液對金黃色葡萄球菌呈高度敏感（抑菌圈直徑為17 mm），對大腸埃希菌呈中度敏感（抑菌圈直徑為11 mm）。

3 討論

本試驗以P188 為載體，采用溶劑熔融法制備了RES-P188-SD。與RES原料藥相比，RES-P188-SD溶解度提高了近17 倍（RES 原料藥溶解度為0.03 mg/ml）。在pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中，RES 15 min累積溶出度僅為12%，物理混合物達(dá)39%，而RES-P188-SD 則達(dá)83%以上?？梢?，制成RES-P188-SD后顯著提高了RES的溶解度和溶出速率。焦艷等[9]曾以聚乙烯吡咯烷酮為載體制備RES 固體分散體，其溶解度為0.23 mg/ml，人工胃液中2 h累積溶出度為88%?？梢姡琍188和聚乙烯吡咯烷酮均對RES的溶解度和溶出度有所改善，但P188的改善作用更加明顯。同時抑菌性試驗結(jié)果表明，RES-P188-SD具有抑菌活性。

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