帕拉米韋氯化鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

喬世琴，孫著葉，李維剛，吳立磊（.日照市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，山東日照 76800；.山東綠因藥業(yè)有限公司，山東臨沂 76000）

帕拉米韋是由美國生物晶體公司研制的一種環(huán)戊烷神經(jīng)氨酸酶抑制劑，是世界首個靜脈途徑治療流感的藥物，該藥可有效抑制各種流感病毒株，具有耐受性好、毒性小等優(yōu)點。2010年由日本鹽野義制藥株式會社推廣上市，用于甲型、乙型流感病毒感染癥的治療[1]。2013年，我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準抗流感新藥帕拉米韋氯化鈉注射液上市，現(xiàn)有臨床試驗數(shù)據(jù)證明該藥對甲型和乙型流感有效[2]。但目前尚未有帕拉米韋氯化鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的文獻報道。為確保臨床用藥安全，筆者采用細菌內(nèi)毒素凝膠檢查法[3-4]檢測了帕拉米韋氯化鈉注射液中細菌內(nèi)毒素，現(xiàn)報道如下。

1 材料

KXB-12A 型恒溫培養(yǎng)箱（上?？莆鲈囼瀮x器廠）；XW-8A型漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；PHS-2F 型雷磁酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；XS 105型電子天平（德國Sartorius公司）。

帕拉米韋氯化鈉注射液（山東綠因藥業(yè)有限公司，批號：130901、130902、130903，規(guī)格：60 ml∶300 mg）；鱟試劑[TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號：1010211，標示靈敏度：0.25 EU/ml；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：1007121，標示靈敏度：0.125 EU/ml）]；細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE，湛江安度斯生物有限公司，批號：1010150，規(guī)格：100 EU/ml）；細菌內(nèi)毒素檢查（BET）用水（湛江安度斯生物有限公司，批號：1011230，規(guī)格：50 ml/瓶）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

參考相關(guān)文獻[5-6]，確定大容量注射液的細菌內(nèi)毒素限值L為0.5 EU/ml。根據(jù)公式L＝K/M計算。K 為人用每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K＝5 EU/（kg·h）；M為人用每千克體質(zhì)量每小時的最大劑量。帕拉米韋氯化鈉注射液靜脈注射最大用藥劑量為600 mg（120 ml），給藥時間每次至少為15 min，平均體質(zhì)量按60 kg計，靜脈注射時間按1 h計，故L＝K/M＝2.5 EU/ml。根據(jù)《化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則》的要求，為保證用藥安全，本研究規(guī)定帕拉米韋氯化鈉注射液的細菌內(nèi)毒素限值為0.5 EU/ml。

2.2 樣品最小有效稀釋濃度（c）的確定

根據(jù)公式c＝λ/L計算。式中，L為0.5 EU/ml，λ為TAL 靈敏度。目前，市售TAL的λ為0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03 EU/ml，得c為5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/ml。

2.3 TAL靈敏度復核試驗

根據(jù)2010年版《中國藥典》（二部）附錄TAL靈敏度復核試驗的方法操作[3]，結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表1[注：“+”表示凝膠形成（陽性）；“－”表示凝膠未形成（陰性）]。

2.4 干擾預試驗

取BET用水將帕拉米韋氯化鈉注射液稀釋成質(zhì)量濃度為5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/ml 的系列濃度溶液，作為供試品陰性對照溶液（NPC）。另制備相同濃度的系列供試品溶液，使每一供試品溶液中含有2.0λ（0.50 EU/ml）的細菌內(nèi)毒素，作為陽性對照溶液（PPC）。另設CSE的陽性對照管（PC）和BET用水陰性對照管（NC）各2管，按細菌內(nèi)毒素檢查法操作，結(jié)果見表2（注：“+”表示陽性反應；“－”表示陰性反應）。

表1 TAL靈敏度復核結(jié)果Tab 1 Recheck results of TAL sensitivity test

表2 樣品干擾預試驗結(jié)果Tab 2 Results of pre-interference test of samples

預試驗結(jié)果表明，帕拉米韋氯化鈉注射液原液對兩批TAL均有強抑制作用，樣品經(jīng)稀釋后，TAL的最大不干擾濃度（2.5 mg/ml）對試驗可能無干擾。

2.5 干擾試驗

根據(jù)預試驗結(jié)果，用質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml 的供試品溶液及BET 用水分別稀釋CSE，制成細菌內(nèi)毒素濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 EU/ml 的系列溶液，與兩批TAL 反應，按2010年版《中國藥典》（二部）附錄中細菌內(nèi)毒素檢查法進行干擾試驗，結(jié)果見表3[注：Es為BET用水制成的細菌內(nèi)毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的細菌內(nèi)毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值；Es＝lg－1（∑Xs/4），Et＝lg－1（∑Xt/4）；“+”表示陽性反應；“－”表示陰性反應]。

試驗結(jié)果表明，Es為2～0.5 EU/ml，Es/Et為0.5～2，說明質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml 的樣品溶液對TAL無干擾，可用于細菌內(nèi)毒素檢查。

2.6 樣品細菌內(nèi)毒素檢查

表3 樣品干擾試驗結(jié)果Tab 3 Results of interference test of samples

取3 批次的樣品各適量，加BET 用水制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml的溶液，使用λ為0.25 EU/ml的TAL，按文獻[7]方法進行細菌內(nèi)毒素檢查，并按要求做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表4（注：“+”表示陽性反應；“－”表示陰性反應）。

表4 細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 4 Results of bacterial endotoxin test

3 討論

細菌內(nèi)毒素檢查法是通過TAL與細菌內(nèi)毒素間產(chǎn)生凝聚反應以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的一種方法，具有操作簡單、檢測周期短、靈敏度高、結(jié)果準確等優(yōu)點[8]。在進行預干擾試驗時，加入BET 用水將帕拉米韋氯化鈉注射液稀釋并溶解到質(zhì)量濃度為2.5 mg/ml時不干擾測定。本試驗中筆者采用兩家不同企業(yè)的TAL對3個批號的樣品進行試驗對比[9]，在樣品質(zhì)量濃度稀釋至2.5 mg/ml及以下時，不干擾細菌內(nèi)毒素檢查。因此，帕拉米韋氯化鈉注射液用凝膠法進行細菌內(nèi)毒素檢查是可行的。

綜上所述，本方法可用于帕拉米韋氯化鈉注射液的細菌內(nèi)毒素檢查。

[1]陳小勇，李佩杰，梁杰.一種帕拉米韋德制備方法：中國，201110034757.9[P].2011-02-09.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理總局.帕拉米韋氯化鈉注射液[EB/OL].（2013-04-05）[2013-08-20].http：//www.sfda.gov.cn/WS01/CL0001/.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄85.

[4]劉海疆，陳志勇，田冰，等.長春西汀氯化鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（1）：108.

[5]李霞.細菌內(nèi)毒素檢查法在藥品申報資料中應注意的問題[J].中國藥事，2007，21（6）：401.

[6]李榮，吳玲.動態(tài)濁度法檢測乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中的細菌內(nèi)毒素[J].中國藥房，2012，23（9）：837.

[7]厲青，陳娟紅，陸金花.注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸內(nèi)毒素檢查方法的建立[J].中國藥房，2013，24（25）：2 376.

[8]周梅，武谷.注射用鹽酸吉西他濱細菌內(nèi)毒素檢查方法的研究[J].中國藥房，2013，24（1）：77.

[9]蔣立云，湯群，堵嫻，等.注射用嗎替麥考酚酯的細菌內(nèi)毒素檢查法可行性研究[J].藥物分析雜志，2013，28（3）：490.