胰島素注射液質(zhì)量現(xiàn)狀及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)研究

丁曉麗，李湛軍，辛中帥，張 慧，梁成罡（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

1921年，Banting和Best首次成功提取胰島素，使糖尿病的治療成為可能；1923年，胰島素開始應(yīng)用于臨床[1]。從來源上，胰島素制劑可分為動(dòng)物胰島素、人胰島素和胰島素類似物[2]。胰島素注射液是從動(dòng)物（豬、牛或羊）胰臟中提取的[3]，屬動(dòng)物胰島素，而由于動(dòng)物胰島素氨基酸序列與人胰島素的差異[4]以及生產(chǎn)工藝本身的缺陷[5]，其對(duì)人體來說是異種蛋白，長(zhǎng)期使用會(huì)引起不同程度的免疫反應(yīng)[6]，易出現(xiàn)過敏反應(yīng)和注射部位皮下脂肪萎縮等[7]。2013 年，艾美仕市場(chǎng)研究公司（IMS Health）市場(chǎng)調(diào)研數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)仍有10.2%的動(dòng)物胰島素使用量，其中中小城市占比高于大城市[8]。筆者曾委托國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心對(duì)胰島素制劑2009年的臨床不良反應(yīng)進(jìn)行了檢索。報(bào)告顯示，當(dāng)年胰島素制劑臨床不良反應(yīng)病例共339例，其中動(dòng)物胰島素報(bào)告250 例，人胰島素報(bào)告89 例，而動(dòng)物胰島素中胰島素注射液報(bào)告213例，占總數(shù)的62.8%。這一數(shù)據(jù)說明，胰島素注射液的不良反應(yīng)發(fā)生率遠(yuǎn)高于其他胰島素制劑，應(yīng)引起重視。

胰島素注射液的原料主要是豬胰島素，該品種pH 呈酸性，因此又稱酸性胰島素注射液。該藥于2009 年列入我國(guó)基本藥物目錄[9]，屬醫(yī)保甲類藥物?！吨袊?guó)藥典》自2000年版開始已不再收載此品種，但截止2010年，市場(chǎng)上仍在廣泛流通和使用，生產(chǎn)企業(yè)22家，批準(zhǔn)文號(hào)27個(gè)。

本研究以市場(chǎng)抽驗(yàn)的32 批胰島素注射液為對(duì)象，按照本品法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了全檢，并參照同類產(chǎn)品的法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)有關(guān)物質(zhì)、含量、苯酚、高分子蛋白質(zhì)及鋅等關(guān)鍵質(zhì)控項(xiàng)目進(jìn)行了分析，以為了解胰島素注射液的質(zhì)量現(xiàn)狀及提高相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 型高效液相色譜（HPLC）儀，包括20AD 泵、SPD-20A紫外可見檢測(cè)器、LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；AA6800 原子吸收分光光度計(jì)（日本島津公司）；XS205DU電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 對(duì)照品

豬胰島素對(duì)照品（批號(hào)：140720-200901，規(guī)格：15 mg/支，純度：90.85%）、胰島素單體-二聚體對(duì)照品（批號(hào)：140634-201303，規(guī)格：約4 mg/瓶，用于系統(tǒng)適用性試驗(yàn)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；苯酚對(duì)照品（批號(hào)：141436340309273，純度≥99.5%）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；鋅單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：GB08620，規(guī)格：1 000μg/ml）購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)院。

1.3 藥品與試劑

胰島素注射液（規(guī)格：10 ml∶400 U，原料均為豬胰島素）樣品共32批，分別抽自18個(gè)省，涉及3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)和3個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)；中性胰島素注射液（規(guī)格：10 ml∶400 U，原料均為豬胰島素），樣品共8 批。乙腈為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Fisher 公司；磷酸、無水硫酸鈉、醋酸、精氨酸、乙醇胺、鹽酸均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為Millipore 超純水機(jī)制備的去離子水。

2 方法

2.1 法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

胰島素注射液的法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為1995 年版《中國(guó)藥典》（二部），具體項(xiàng)目見表1。

表1 胰島素注射液法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Statutory specification of Insulin injection

2.2 關(guān)鍵質(zhì)控項(xiàng)目

參照2010年版《中國(guó)藥典》（二部）重組人胰島素注射液及中性胰島素注射液的法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[10]，對(duì)胰島素注射液分別進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)、含量、苯酚、高分子蛋白質(zhì)、鋅等關(guān)鍵質(zhì)控項(xiàng)目的考察。

2.2.1 有關(guān)物質(zhì) 采用RP-HPLC 法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Grace Vydac C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，300 ?）；流動(dòng)相A 為0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液（取無水硫酸鈉28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 ml、水800 ml，用乙醇胺調(diào)節(jié)pH 至2.3，加水至1 000 ml）-乙腈（82∶18，V/V），流動(dòng)相B 為乙腈-水（50∶50，V/V），采用梯度洗脫（0～36 min，22%→22%B；36～61 min，22%→67%B；61～67 min，67%→67%B，調(diào)節(jié)流動(dòng)相B的比例，使重組人胰島素主峰的保留時(shí)間約為25 min）；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為20 μl。以胰島素注射液作為供試品溶液。采用面積歸一化法，計(jì)算A21脫氨胰島素及其他有關(guān)物質(zhì)的含量。

2.2.2 含量測(cè)定 采用RP-HPLC 法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Grace Vydac C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，300 ?）；流動(dòng)相為0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液（pH 2.3）-乙腈（74∶26或適宜比例，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；流速為1 ml/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為20 μl。精密稱取豬胰島素對(duì)照品適量，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并制成質(zhì)量濃度約為0.35 mg/ml 的溶液，作為對(duì)照品溶液；精密量取胰島素注射液2.5 ml，加0.01 mol/L 鹽酸稀釋至10 ml，作為供試品溶液。采用外標(biāo)法，以胰島素主峰峰面積與A21脫氨胰島素峰面積之和計(jì)算含量。

2.2.3 高分子蛋白質(zhì) 采用高效液相分子排阻色譜（HPSEC）法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Waters Insulin HMWP（300 mm×7.8 mm，10 μm，125 ?）；流動(dòng)相為冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15∶20∶65，V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm；流速為0.5 ml/min；進(jìn)樣量為100 μl。以胰島素注射液作為供試品溶液。采用面積歸一化法，計(jì)算高分子蛋白質(zhì)的含量。

2.2.4 苯酚 采用RP-HPLC法進(jìn)行測(cè)定。色譜條件同“2.2.2”項(xiàng)，但檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。精密稱取苯酚對(duì)照品適量，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并制成質(zhì)量濃度約為0.25 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液；精密量取胰島素注射液1 ml，加0.01 mol/L鹽酸稀釋至10 ml，作為供試品溶液。采用外標(biāo)法，計(jì)算苯酚的含量。

2.2.5 鋅 精密量取鋅單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用0.01 mol/L鹽酸溶液分別稀釋成鋅質(zhì)量濃度為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取胰島素注射液1 ml，加0.01 mol/L 鹽酸稀釋至25 ml，作為供試品溶液。按照2010 年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅣD 第一法原子吸收分光光度法[10]測(cè)定，并計(jì)算鋅的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 法定檢驗(yàn)

32 批樣品檢驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。其中，生物法測(cè)定胰島素效價(jià)的結(jié)果分布在91%～116%，詳見圖1。

3.2 有關(guān)物質(zhì)

胰島素注射液的有關(guān)物質(zhì)色譜見圖2。結(jié)果表明，32批樣品中雜質(zhì)A21脫氨胰島素含量分布在15.6%～39.2%，超出同類產(chǎn)品規(guī)定的5.0%的限度標(biāo)準(zhǔn)，詳見圖3。其他有關(guān)物質(zhì)含量分布在0.4%～0.6%，低于同類產(chǎn)品規(guī)定的6.0%的限度標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 胰島素注射液效價(jià)測(cè)定結(jié)果Fig 1 Titer determination results of Insulin injection

圖2 胰島素注射液有關(guān)物質(zhì)色譜圖1.防腐劑；2.胰島素；3.A21脫氨胰島素Fig 2 Chromatograms of related impurities in Insulin injection1.preservative；2.insulin；3.A21desamido insulin

圖3 胰島素注射液中A21脫氨胰島素測(cè)定結(jié)果Fig 3 Determination results of A21desamido insulin in Insulin injections

A21脫氨胰島素是胰島素注射液常見的雜質(zhì)，A21脫氨胰島素含量過高會(huì)影響胰島素的療效及穩(wěn)定性[11]?，F(xiàn)行各國(guó)藥典胰島素原料及相關(guān)制劑品種項(xiàng)下，均對(duì)A21脫氨胰島素及其他有關(guān)物質(zhì)有嚴(yán)格的限度規(guī)定[12]：“A21脫氨胰島素不得過5.0%，其他有關(guān)物質(zhì)總和不得過6.0%?！北狙芯拷Y(jié)果顯示，胰島素注射液中A21脫氨胰島素含量普遍偏高。分析發(fā)現(xiàn)，這是由胰島素注射液的生產(chǎn)工藝及處方導(dǎo)致的。胰島素注射液是一個(gè)比較老的品種，由于早期純化工藝的局限性，胰島素注射液中含有一定量的蛋白水解酶，而酸性環(huán)境可以抑制蛋白水解酶對(duì)胰島素的降解[13]，因此胰島素的處方是酸性的，pH 保持在2.5～3.5。但是胰島素在酸性條件下不穩(wěn)定，易引起A21位門冬酰胺的脫氨基反應(yīng)，形成A21脫氨胰島素，導(dǎo)致A21脫氨胰島素含量較高，使胰島素注射液的穩(wěn)定性降低，貨架期質(zhì)量不可控。

目前，動(dòng)物胰島素的生產(chǎn)工藝經(jīng)歷了從粗提胰島素、結(jié)晶胰島素到高純胰島素的進(jìn)步[8]，隨著胰島素純化工藝的提高，蛋白水解酶的含量已經(jīng)大大降低，蛋白水解酶對(duì)胰島素的降解已變成次要因素，胰島素注射液的處方也無須再保持酸性環(huán)境，于是研制出了中性胰島素注射液。本研究同時(shí)抽取了8批中性胰島素注射液并對(duì)其進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，樣品中A21脫氨胰島素的含量均小于0.1%。與胰島素注射液相比，中性胰島素注射液的A21脫氨胰島素含量較低，穩(wěn)定性較好，詳見圖4。

3.3 含量測(cè)定

RP-HPLC 測(cè)定方法中，胰島素的含量是以胰島素主峰峰面積與A21脫氨胰島素峰面積之和進(jìn)行計(jì)算，因此含量過高的A21脫氨胰島素沒有對(duì)胰島素注射液的含量測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，32批樣品含量測(cè)定結(jié)果為93.2%～102.7%，符合同類產(chǎn)品規(guī)定的90.0%～110.0%限度標(biāo)準(zhǔn)，詳見圖5。

圖4 胰島素注射液與中性胰島素注射液有關(guān)物質(zhì)色譜圖A.胰島素注射液；B.中性胰島素注射液；1.防腐劑；2.胰島素；3.A21脫氨胰島素Fig 4 Chromatograms of related impurities in Insulin injection and Neutral insulin injectionA.Insulin injection；B.Neutral insulin injection；1.preservative；2.insulin；3.A21desamido insulin

圖5 胰島素注射液含量測(cè)定結(jié)果Fig 5 Contents determination results of Insulin injection

然而，RP-HPLC法含量測(cè)定結(jié)果也顯示，胰島素主峰已降解為59.9%～83.8%，但由于A21脫氨胰島素具有與胰島素相似的生物活性，生物法測(cè)定胰島素效價(jià)的結(jié)果仍為91%～116%。說明胰島素注射液的法定標(biāo)準(zhǔn)中僅僅采用生物法測(cè)定胰島素效價(jià)，胰島素主峰大量降解的現(xiàn)象會(huì)被掩蓋。目前，各國(guó)現(xiàn)行藥典及我國(guó)進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰島素原料及制劑均采用RP-HPLC 法進(jìn)行含量測(cè)定，該方法能更加及時(shí)并準(zhǔn)確地反映出胰島素注射液的穩(wěn)定性變化情況，適用于胰島素注射液產(chǎn)品的放行標(biāo)準(zhǔn)及對(duì)其有關(guān)物質(zhì)及主峰含量進(jìn)行監(jiān)控。

3.4 其他

胰島素注射液中高分子蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果分布在0.5%～0.6%，符合同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的不得過2.0%的限度，詳見圖6；苯酚測(cè)定結(jié)果在2.34～2.51 mg/ml，符合同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的2.00～2.75 mg/ml 的限度，詳見圖7；鋅測(cè)定結(jié)果分布在12.3～14.8μg/100 U，符合同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的10～40μg/100 U的限度，詳見圖8。胰島素分子具有復(fù)雜的自聚合特性[14]，易形成二聚體及多聚體等高分子蛋白質(zhì)，有可能引起過敏反應(yīng)。胰島素注射液是通過2個(gè)鋅離子（Zn2+）把6個(gè)分子聚集在一起形成六聚體結(jié)晶體，Zn2+和苯酚能夠顯著增強(qiáng)六聚體的穩(wěn)定性[15]，因此，高分子蛋白質(zhì)、苯酚及鋅含量的控制與胰島素的藥效作用密切相關(guān)，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。本研究結(jié)果顯示，各廠家產(chǎn)品在高分子蛋白質(zhì)、苯酚及鋅含量等方面整體上控制較好。

4 結(jié)論

4.1 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

胰島素注射液自2000 年版《中國(guó)藥典》開始就不再收載，其法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)一直執(zhí)行1995年版《中國(guó)藥典》。該法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)缺少有關(guān)物質(zhì)、含量測(cè)定、苯酚、高分子蛋白質(zhì)、鋅含量測(cè)定等多個(gè)關(guān)鍵質(zhì)控項(xiàng)目，無法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量實(shí)現(xiàn)有效控制。

圖6 胰島素注射液中高分子蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果Fig 6 Determination results of protein polymer in Insulin injection

圖7 胰島素注射液中苯酚測(cè)定結(jié)果Fig 7 Determination results of phenol in Insulin injection

圖8 胰島素注射液中鋅含量測(cè)定結(jié)果Fig 8 Content determination results of Zn in Insulin injection

4.2 產(chǎn)品質(zhì)量現(xiàn)狀

抽驗(yàn)的各批胰島素注射液中，A21脫氨胰島素含量普遍較高，盡管其具有與胰島素相似的生物活性，但胰島素的不斷降解致使產(chǎn)品穩(wěn)定性降低，貨架期質(zhì)量不可控，存在潛在的安全隱患，故不容輕視。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)提高

本研究結(jié)果上報(bào)了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，鑒于胰島素注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品質(zhì)量狀況，總局發(fā)布實(shí)施了國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂件（XGB2011-094），對(duì)1995 年版《中國(guó)藥典》（二部）胰島素注射液及2010年版《中國(guó)藥典》（二部）中性胰島素注射液兩品種合并，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均為2010年版《中國(guó)藥典》（二部）中性胰島素注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為公眾用藥的安全性及有效性提供了保障。

4.4 思考

在胰島素制劑缺乏的年代，胰島素注射液對(duì)于滿足患者尤其是低收入群體患者的用藥可及性起到了重要的歷史作用。但目前，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組人胰島素將逐步取代動(dòng)物胰島素，同時(shí)胰島素制劑及胰島素類似物也在不斷開發(fā)與研制[18]，各種胰島素產(chǎn)品相繼問世，為不同群體的糖尿病患者提供了更多的選擇空間。2013年《中國(guó)2型糖尿病防治指南（基層版）》建議：在胰島素種類的選擇上推薦使用人胰島素，盡量不用動(dòng)物胰島素[17]。但對(duì)于經(jīng)濟(jì)狀況確實(shí)比較困難、醫(yī)療保障及醫(yī)療條件較差的群體，建議考慮使用穩(wěn)定性相對(duì)較好且安全系數(shù)相對(duì)較高的動(dòng)物胰島素品種。

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