雷公藤多苷對(duì)大鼠與人肝微粒體CYP3A酶活性的體外抑制作用Δ

夏 軍，夏宗玲（1.江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院，江蘇 常州 1300；.常州市第一人民醫(yī)院，江蘇 常州 13003）

雷公藤多苷（Tripterygium glycosides，又稱雷公藤總苷）為雷公藤根經(jīng)提取、純化而成的中藥制劑，其主要藥理作用為免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。臨床上主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎臟疾病、白塞氏病、麻風(fēng)反應(yīng)、肝臟疾病、皮膚病、黏膜病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的治療，應(yīng)用較廣泛。臨床應(yīng)用雷公藤多苷片時(shí)，常與依那普利、苯那普利、雙嘧達(dá)莫、卡托普利、環(huán)磷酞胺、糖皮質(zhì)激素、鈣拮抗藥等藥物合用。如果雷公藤多苷能夠影響細(xì)胞色素P450（CYP）酶系某個(gè)亞型的活性，就會(huì)影響由該亞型參與代謝的其他合并用藥物的藥動(dòng)學(xué)特性，從而影響該藥的療效和不良反應(yīng)，產(chǎn)生藥物間的相互作用。

雷公藤多苷片的主要活性成分為雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯甲，成分較復(fù)雜。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)研究表明雷公藤多苷片對(duì)大鼠體內(nèi)CYP2E1 酶活性影響較小，而對(duì)CYP3A 酶活性有抑制作用[1]。國內(nèi)文獻(xiàn)僅有雷公藤內(nèi)酯醇在大鼠和人體外羥基化代謝的研究和雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠肝微粒體體外蛋白表達(dá)的研究[2-3]，以及雷公藤活性成分對(duì)大鼠體內(nèi)CYP活性的影響[4]，不足以說明雷公藤多苷對(duì)CYP的抑制作用。經(jīng)國內(nèi)文獻(xiàn)檢索尚未見有關(guān)雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體體外代謝影響的相關(guān)報(bào)道。因此，本課題組進(jìn)一步開展了雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP3A代謝活性影響的研究。

本課題組分別建立大鼠和人肝微粒體體外代謝模型以及1′-羥基咪達(dá)唑侖含量測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法，以咪達(dá)唑侖作為代謝底物，研究雷公藤多苷對(duì)CYP3A酶活性的抑制作用。

1 材料

1.1 儀器

1290/6460 型液相色譜儀串聯(lián)三聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Optima MAX-XP 超速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；低溫冰箱（日本Sanyo 公司）；XW-80A 型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；DKZ-2 型恒溫振蕩水槽（上海精宏儀器設(shè)備有限公司）；FM70型雪花制冰機(jī)（北京長流科學(xué)儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤多苷原料藥[浙江得恩德制藥有限公司，批號(hào)：1304701，含量：4.86 mg/g（以雷公藤內(nèi)酯甲計(jì)）]；咪達(dá)唑侖對(duì)照品（批號(hào)：171250-201002，純度：＞99.8%）、氯雷他定對(duì)照品（批號(hào)：100615-200602，純度：99%）購自中國食品藥品檢定研究院；1′-羥基咪達(dá)唑侖對(duì)照品（浙江大學(xué)藥物分析與代謝研究室余露山教授饋贈(zèng)，純度：99.5%）；氧化型輔酶Ⅱ（β-NADP）、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、枸櫞酸、枸櫞酸脫氫酶均購于美國Sigma 公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，水為18 MΩ水。

1.3 動(dòng)物

1.4 肝微粒體

混合人肝微粒體[10 個(gè)個(gè)體混合，瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司，蛋白質(zhì)量濃度：20 mg/ml，規(guī)格：1 ml/包]；大鼠肝微粒體（10只大鼠混合微粒體）由筆者采用鈣離子沉淀法制備（蛋白質(zhì)量濃度：20 mg/ml，規(guī)格：1 ml/包）[5-7]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XBD-C18（50 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：水（A）-甲醇（B），梯度洗脫；流速：0.3 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μl。流動(dòng)相比例變化見表1。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧氣壓：45 psi；霧化器溫度：350 ℃；電噴霧電壓：3 500 V；噴頭電壓：500 V；氣流速度：5 L/min；掃描時(shí)間：6 min。定量離子與質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表1 流動(dòng)相比例變化Tab 1 Proportional change in the mobile phase

表2 定量離子與質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Quantitative ion and mass spectrometric parameters

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取咪達(dá)唑侖和1′-羥基咪達(dá)唑侖對(duì)照品適量，分別用二甲基亞砜（DMSO）制備成1 mmol/L的溶液作為貯備液，然后采用逐級(jí)稀釋的方法，制備系列混合對(duì)照品溶液，4 ℃貯藏，備用。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取氯雷他定對(duì)照品適量，用DMSO制備成質(zhì)量濃度為8 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃貯藏，備用。

2.3.3 質(zhì)控樣品的制備 分別取不同濃度的混合對(duì)照品系列溶液10 μl 與內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，加入100 μl 空白肝微粒體中，得高、中、低（3、0.3、0.03 μmol/L）3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，4 ℃貯藏，備用。

2.4 肝微粒樣品的處理

分別精密吸取大鼠與人肝微粒體適量，以下操作均在4 ℃冰浴中進(jìn)行：用新鮮配制的枸櫞酸-枸櫞酸脫氫酶再生系統(tǒng)稀釋成肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度為0.4 mg/ml 的混懸液；取此混懸液0.2 ml，加入底物咪達(dá)唑侖使其終濃度為5 μmol/L，并同時(shí)分別加入不同質(zhì)量濃度的雷公藤多苷溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/ml（該孵育體系中含有機(jī)溶劑為0.5%），混勻，于37 ℃預(yù)孵育5 min；加β-NADP/NADPH 的0.1%NaHCO3溶液（臨用新配，置于冰浴中，β-NADP、NADPH 的終濃度分別為0.25、0.1 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，并開始記時(shí)；37 ℃下孵育20 min 后，加入2倍體積的含80 ng/ml內(nèi)標(biāo)氯雷他定的冰冷乙腈溶液沉淀蛋白，終止反應(yīng)，渦旋1 min，16 000×g離心15 min，取上清液進(jìn)樣2 μl，測定咪達(dá)唑侖代謝產(chǎn)物1′-羥基咪達(dá)唑侖質(zhì)量濃度。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法專屬性 分別取空白微粒體、標(biāo)準(zhǔn)樣品、孵育液樣品（雷公藤多苷質(zhì)量濃度為10 μg/ml），按“2.4”項(xiàng)下方法處理樣品后，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，1′-羥基咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為2.94、3.6 min左右，肝微粒中所含的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物和內(nèi)標(biāo)的測定，且二者峰形良好。圖譜見圖1。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按“2.3”項(xiàng)下方法制備混合對(duì)照品系列液（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、3 μmol/L），按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。以1′-羥基咪達(dá)唑侖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、1′-羥基咪達(dá)唑侖與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得大鼠、人肝微粒體線性回歸方程分別為y＝1.055 806x+0.076 414（r＝0.990 5），y＝83.621x+3.168（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，在大鼠、人肝微粒體中1′-羥基咪達(dá)唑侖檢測濃度在0.01～3 μmol/L范圍內(nèi)與其和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值呈良好線性關(guān)系；定量限為0.01 μmol/L（RSD＜13%，n＝5）。

圖1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖A.空白微粒體；B.標(biāo)準(zhǔn)樣品；C.孵育液樣品；1.內(nèi)標(biāo)；2.咪達(dá)唑侖Fig 1 LC-MS/MS chromatogramsA.blank microsomes；B.standard samples；C.incubation fluid samples；1.internal standard；2.midazolam

2.5.3 精密度試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備高、中、低濃度的質(zhì)控樣品各5份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件考察日內(nèi)精密度（5次）、日間精密度（3 d）。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 日內(nèi)、日間精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果（）Tab 3 Results of the precision test and the recovery test（）

表3 日內(nèi)、日間精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果（）Tab 3 Results of the precision test and the recovery test（）

2.5.4 回收率試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備高、中、低濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品各5 份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件測定。將測得峰面積比值代入回歸方程，計(jì)算測定值并與加入量比較，計(jì)算提取回收率。測得峰面積比值后與同濃度對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣所得峰面積比值進(jìn)行比較，計(jì)算方法回收率?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見表3。

2.5.5 樣品穩(wěn)定性考察 取“2.3”項(xiàng)下高、中、低濃度的質(zhì)控樣品各5份，在37 ℃孵育0、1 h后，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定，考察37 ℃孵育樣品的穩(wěn)定性；取“2.3”項(xiàng)下高、中、低濃度的質(zhì)控樣品各5 份，于4 ℃放置24 h 后測定，考察4 ℃進(jìn)樣器中放置樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果，RSD均小于10%，表明樣品在37 ℃孵育1 h及4 ℃進(jìn)樣器中放置穩(wěn)定。

2.6 抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50）的計(jì)算[8]

在孵化體系中加入不同濃度的待測藥物，分別求得其代謝抑制率，采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行非線性回歸，并得到本試驗(yàn)條件下待測藥物的IC50。藥物對(duì)CYP3A的抑制作用采用1′-羥基咪達(dá)唑侖生成速率的降低（即抑制率）表示，抑制率參照下式計(jì)算：

抑制率＝（m0－m1）/m0×100%

式中：m0為空白溶劑對(duì)照時(shí)探針?biāo)幬锎x物（1′-羥基咪達(dá)唑侖）的生成量；m1為加入系列濃度待測藥物后探針?biāo)幬锎x物（1′-羥基咪達(dá)唑侖）的生成量。

本試驗(yàn)用抑制率來表示藥物對(duì)酶代謝抑制作用的強(qiáng)弱，數(shù)值越高表示抑制作用越強(qiáng)。

2.7 雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP3A 酶活性的抑制率檢測結(jié)果

由檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著雷公藤多苷質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)酶活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)。雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP3A酶活性抑制率的檢測結(jié)果見表4。

表4 雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP3A酶活性抑制率的檢測結(jié)果（，n＝3）Tab 4 Inhibition rate of tripterygium glycosides on the acticity of CYP3A in rats and human liver microsomal enzyme（，n＝3）

表4 雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP3A酶活性抑制率的檢測結(jié)果（，n＝3）Tab 4 Inhibition rate of tripterygium glycosides on the acticity of CYP3A in rats and human liver microsomal enzyme（，n＝3）

2.8 雷公藤多苷IC50的測定結(jié)果

經(jīng)GraphPad Prism 5.0 軟件計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體均有明顯抑制作用，對(duì)大鼠微粒體中CYP3A 的IC50為（48.610±1.32）μg/ml，對(duì)人微粒體中CYP3A的IC50為（4.754±1.12）μg/ml。雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP3A酶活性的抑制作用曲線見圖2。

圖2 雷公藤多苷對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP3A酶活性的抑制作用曲線A.大鼠；B.人Fig 2 Inhibition curve of tripterygium glycosides on the acticity of CYP3A in rat and human liver microsomesA.rat；B.human

3 討論

3.1 分析方法的確定

由方法學(xué)結(jié)果可見，本實(shí)驗(yàn)室建立的LC-MS/MS 方法專屬性好、測定速度快；在此色譜條件下代謝物、內(nèi)標(biāo)出峰良好，且系統(tǒng)耐用性也較好，試驗(yàn)條件的微小差異不會(huì)影響其分離測定。在內(nèi)標(biāo)物的選擇上，筆者考慮到內(nèi)標(biāo)物和待測物結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)及化學(xué)性質(zhì)相近的原則[8-9]，選擇了同樣含有七元環(huán)、理化性質(zhì)相似的氯雷他定作為內(nèi)標(biāo)物。其與1′-羥基咪達(dá)唑侖出峰時(shí)間相近，不會(huì)延長測定時(shí)間，且能較好地分離。

3.2 代謝模型的選擇

目前常用的體外代謝模型中肝微粒體模型含有肝臟表達(dá)的所有參與藥物代謝的CYP 酶，且易于制備和保存而被廣泛用于藥物的氧化代謝研究，已被美國FDA 認(rèn)可用于新藥代謝途徑和對(duì)CYP酶抑制或誘導(dǎo)作用的研究[10]。因此本研究選擇肝微粒模型研究雷公藤多苷對(duì)CYP3A的抑制作用。

3.3 抑制作用的判定

對(duì)于化學(xué)藥品常用IC50評(píng)判其對(duì)肝藥酶抑制能力的大?。喝鬒C50＜1 μmol/L，則初步表明藥物對(duì)該CYP 抑制能力強(qiáng)；若IC50＞50 μmol/L，則表明藥物對(duì)該CYP抑制能力弱。根據(jù)IC50的大小可以初步了解藥物對(duì)CYP是否有強(qiáng)抑制作用[11]。但對(duì)于分子質(zhì)量不明確的中藥尤其是中藥復(fù)方制劑對(duì)CYP酶抑制作用的強(qiáng)弱還沒有公認(rèn)的評(píng)判依據(jù)。有文獻(xiàn)提到有關(guān)抑制作用的評(píng)判依據(jù)，認(rèn)為加入待測藥物后代謝產(chǎn)物的生成速率超過10%被認(rèn)為是有明顯影響[12]。由本試驗(yàn)大鼠肝微粒體CYP3A酶活性的抑制率數(shù)據(jù)可見，當(dāng)雷公藤多苷質(zhì)量濃度超過0.5 μg/ml時(shí)，即表現(xiàn)出對(duì)CYP3A酶活性的抑制作用；同樣人肝微粒體CYP3A酶活性的抑制率亦表現(xiàn)出對(duì)酶的抑制作用，且隨質(zhì)量濃度的增大，抑制作用明顯增強(qiáng)。

3.4 種屬差異

雖然大鼠肝微粒體與人類相似度極高，但是仍存在一定的種屬差異，這就可能導(dǎo)致藥物在這兩個(gè)種屬體內(nèi)的代謝途徑和代謝產(chǎn)物的差異。因此，本課題組選擇同時(shí)用大鼠和人肝微粒體體外代謝模型進(jìn)行研究，在研究雷公藤多苷對(duì)CYP3A酶活性影響的同時(shí)，考察雷公藤多苷代謝的種屬差異，減少因種屬差異而造成試驗(yàn)結(jié)果的誤差。

本研究分別選用了大鼠和人的肝微粒體體外代謝模型來研究雷公藤多苷對(duì)藥物代謝酶CYP3A的影響，以氯雷他定作為內(nèi)標(biāo)，采用LC-MS/MS法測定咪達(dá)唑侖主要代謝產(chǎn)物1′-羥基咪達(dá)唑侖的生成量的變化，以此評(píng)價(jià)藥物對(duì)CYP3A酶活性的影響。經(jīng)GraphPad Prism 5.0軟件擬合計(jì)算得到雷公藤多苷對(duì)大鼠微粒體中CYP3A 的IC50為（48.610±1.32）μg/ml，對(duì)人微粒體中CYP3A的IC50為（4.754±1.12）μg/ml。結(jié)果顯示，雷公藤多苷對(duì)不同種屬體內(nèi)CYP3A的抑制作用不同，對(duì)人的抑制作用明顯強(qiáng)于大鼠，存在種屬差異。這種差異也可能是由于大鼠和人體中CYP3A含量的差異引起的。

雷公藤多苷含有多種成分且成分較為復(fù)雜，通過研究雷公藤在大鼠體內(nèi)、體外及人體外肝微粒中對(duì)CYP 酶活性的影響，可為臨床醫(yī)師科學(xué)、安全、合理使用雷公藤多苷片提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果提示臨床醫(yī)師在聯(lián)合使用雷公藤多苷片和CYP3A參與代謝的藥物時(shí)，前者可使后者藥動(dòng)學(xué)特性發(fā)生明顯的變化；應(yīng)適當(dāng)減少后者的給藥劑量，以避免嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。

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