RP-HPLC法同時測定石韋中4種氨基酸的含量Δ

龍 毅，楊武德，袁吉虎（貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院化學(xué)教研室，貴陽 550002）

石韋為蕨類植物水龍骨科植物石韋Pyrrosia lingua（Thunb.）Farwell的全草，別名有柄石韋、刀尖藥、石茶葉；主治利尿通淋：用于泌尿系威染、小便不利、淋瀝澀痛等（治泌尿系結(jié)石）；清熱止血：用于熱證吐血、血崩等；此外，石韋水煎劑還有一定的抗過敏作用，還可升高因化療及放療引起的白細胞減少[1]。石韋是貴州各民族的常用藥。目前，市面上有治療結(jié)石的復(fù)方石韋片等多種制劑，市場效益顯著。石韋所含的氨基酸具有調(diào)節(jié)人體生理機能、增強免疫力的功效[2-3]。本研究以異硫氰酸苯酯（PITC）為衍生試劑[4-5]，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時對石韋中4 種氨基酸進行分析[6-7]。

1 材料

LC-20AT 型HPLC 儀，包括SPD-20A 檢測器、二元高壓梯度泵、CTO-20A 柱溫箱、LC Solution Lite 化學(xué)工作站（日本島津公司）；JT-5003型千分之一電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；HS10260D型超聲波清洗儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；SHZ-95 型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；YHG-600-BS-Ⅱ型遠紅外快速干燥箱（上海賀德實驗設(shè)備廠）；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）。

亮氨酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：876-200204，純度：99%）；谷氨酸對照品（批號：120515，純度≥99%）、甘氨酸對照品（批號：120529，純度≥99%）、丙氨酸對照品（批號：120329，純度≥99%）均由成都植標化純生物技術(shù)有限公司提供；乙腈為色譜純，醋酸鈉、三乙胺、苯酚、濃鹽酸均為分析純，水為純凈水。

試驗藥材于2011 年6 月采自貴州凱里市雷山縣，由貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文副教授鑒定為石韋屬水龍骨科蕨類植物石韋P.lingua（Thunb.）Farwell 的全草。植物標本存放于貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥研究所植物化學(xué)教研室（標本憑證：GY20110620）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.1 mol/L 的醋酸鈉緩沖液（以醋酸鈉調(diào)節(jié)pH 至6.5）-乙腈（93∶7，V/V），流動相B：乙腈-水（4∶1，V/V），采用梯度洗脫（0～20 min，100%→96%A；20～40 min，80%→78%A；40～45 min，70%→0A；45～55 min，0A）；檢測波長：254 nm；柱溫：300 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：5 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 稱取研勻后的樣品粉末0.6 g，精密稱定，置于安瓿瓶中，加入水解液（含0.5%苯酚的50%鹽酸溶液）10 ml，熔封安瓿，用紗布包裹，于150 ℃水解1 h，放冷，濾過，用水清洗濾渣，合并濾液和洗液于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣用0.1 mol/L鹽酸溶液15 ml分3次溶解洗滌，并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液[8]及1 mol/L三乙胺-乙腈溶液各2.5 ml，混勻，室溫放置1 h，加50%乙腈至刻度；精密量取10 ml，加正己烷15 ml，放置20 min，取下層溶液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.2 對照品溶液 取4 種氨基酸對照品適量，精密稱定，分別加入0.1 mol/L 鹽酸溶液制成每1 ml 分別含谷氨酸0.123 mg、甘氨酸0.079 2 mg、丙氨酸0.065 mg、亮氨酸0.072 mg的溶液，作為對照品貯備液。取上述對照品貯備液5 ml，置于25 ml量瓶中，加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液及1 mol/L三乙胺-乙腈溶液至刻度，混勻；精密量取10 ml，加正己烷15 ml，放置20 min，取下層溶液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.3 陰性空白溶液 取空白安瓿瓶，自“2.2.1”項下“加入水解液（含0.5%苯酚的50%鹽酸溶液）10 ml”起操作制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密稱取上述對照品溶液、供試品溶液、對照品加供試品溶液、陰性空白溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結(jié)果，樣品中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸的理論板數(shù)分別為5 760.1、6 542.1、3 421.3、4 250.6，分離度分別為2.3、2.0、1.5、1.6，分離度符合要求。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.供試品加對照品；D.陰性空白；1.谷氨酸；2.甘氨酸；3.丙氨酸；4.亮氨酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substances；B.test samples；C.reference substance and test samples；D.negative blank solution；1.glutamate；2.glycine；3.alanine；4.leucine

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下對照品貯備液1、2、3、5、10 ml，分別置于25 ml 量瓶中，按“2.2.2”項下方法自“置25 ml 量瓶中，加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液”起操作，得系列濃度溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸的回歸方程分別為y＝1.6×107x－21 487（r＝0.999 1）、y＝4.3×107x－35 870（r＝0.999 9）、y＝2.8×107x－23 652（r＝0.999 4）、y＝3.8×107x+6 646.9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸的質(zhì)量濃度分別在4.92～49.2、3.168～31.68、2.6～26、2.88～28.8 μg/ml范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸峰面積的RSD分別為1.9%、1.8%、1.6%、1.6%（n＝6），表明儀器精密度良好[9]。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液適量，分別于放置0、4、6、8、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結(jié)果，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸峰面積的RSD分別為1.4%、2.1%、1.9%、2.2%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品6 份，每份約0.6 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結(jié)果，谷氨酸平均含量為1.19 mg/g（RSD＝2.2%，n＝6）；甘氨酸平均含量0.699 mg/g（RSD＝1.7%，n＝6）；丙氨酸平均含量為0.359 mg/g（RSD＝1.9%，n＝6），亮氨酸平均含量為0.344 mg/g（RSD＝2.1%，n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品9 份，每份約0.3 g，分別置于5 ml 安瓿中，精密加入對照品溶液（0.123 mg/ml 的谷氨酸2.89 ml，0.079 2 mg/ml 的甘氨酸2.65 ml，0.065 mg/ml 的丙氨酸1.66 ml，0.072 mg/ml 的亮氨酸1.43 ml），加入1%苯酚鹽酸溶液適量，搖勻，按“2.2.1”項下自“熔封安瓿，用紗布包裹，于150 ℃水解1 h”起操作，制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

取樣品粉末0.6 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝6）

3 討論

3.1 氨基酸的柱前衍生化RP-HPLC法注意事項

本試驗在制備供試品溶液時，最重要的就是衍生化反應(yīng)要完全，衍生化程度能決定氨基酸檢測的準確性。本試驗采用茚三酮與氨基酸生成紫色化合物或黃色化合物計算所需衍生劑的量。試驗所需的衍生化試劑PITC有一定毒性，保存時須防止與水接觸，以保持良好活性。氨基酸為兩性物質(zhì)，pH對其分離度影響較大，因此要保證流動相pH的準確與穩(wěn)定。

3.2 柱前衍生化原理

本試驗所選用的PITC 可與一、二級氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC），該衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，對測定無干擾。衍生化試劑、反應(yīng)條件和反應(yīng)時間的選擇不受色譜系統(tǒng)的限制。

綜上所述，本方法操作簡便，結(jié)果準確，重復(fù)性好，可用于石韋中4種氨基酸的含量測定。

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