HPLC 指紋圖譜結合共有模式識別評價重慶市售青蒿飲片質(zhì)量的一致性Δ

賈成友，趙鳳平，李 微，陳 嬌，楊榮平，#，王云紅（.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 637；.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

青蒿（Artemisia apiacea）系菊科植物黃花蒿（Artemisia annuaL.）的干燥地上部分，具有清熱、解暑、除蒸、截瘧的功效，主治暑熱、暑濕、濕溫、陰虛發(fā)熱、瘧疾、黃疸等證[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，青蒿在抗瘧、抗腫瘤、抗菌殺蟲、抑制免疫功能亢進、抗心律失常、抗孕、抗單純皰疹病毒等方面作用明顯，同時可用于紅斑狼瘡的治療及降低機體本身對類風濕性關節(jié)炎的過度免疫[2-3]。從青蒿中提取分離出的青蒿素，具有抗瘧、抗菌、抗腫瘤、解熱、增強免疫等藥理活性，尤其適宜于惡性瘧疾、腦型瘧疾的治療，是世界衛(wèi)生組織推薦的治療瘧疾的首選藥物[4-5]。目前，國內(nèi)有關青蒿質(zhì)量評價的研究多以青蒿素、青蒿酸等指標性成分為主。本研究采用高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜對不同批次的青蒿的相似度進行評價，并采用主成分分析、聚類分析相結合的方法對指紋圖譜進行共有模式識別，探討飲片質(zhì)量的差異性，以為客觀評價青蒿飲片質(zhì)量提供參考。

1 材料

20A系列HPLC儀，配有二元泵、在線脫氣、二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱（日本島津公司）；AUW-220 型萬分之一電子天平（日本島津公司）；CPA225D 型十萬分之一電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；SY2000 型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SB-5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率：300 W，頻率：50 kHz）。

東莨菪內(nèi)酯、青蒿素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110768-200504、100202-201004）；青蒿酸對照品（四川生物試劑有限公司，批號：120628）；甲醇（安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司，色譜純），磷酸（重慶申渝化學試劑廠，分析純），95%乙醇[重慶川東化工（集團）有限公司，分析純]，水為自制超純水。

青蒿飲片（批次：S1～S12）購自重慶市各大藥店，經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為菊科植物黃花蒿A.annuaL.的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTerra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為甲醇，流動相B 為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取青蒿素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯對照品各適量，精密稱定，分別加入甲醇制成每1 ml含青蒿素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯0.300、0.096、0.030 mg的單一對照品溶液，經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 取青蒿藥材粉末（過40 目篩）2.5 g，精密稱定，置于250 ml 圓底燒瓶中，加入95%乙醇150 ml，加熱回流2 h，冷卻，分取乙醇液，續(xù)濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，殘渣加甲醇溶解并移至50 ml 量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液10 μl，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次。結果，青蒿素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.81%、0.73%、0.69%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密稱取藥材粉末（S3）約2.5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以東莨菪內(nèi)酯為內(nèi)參峰。結果，各主要共有峰相對保留時間的RSD 為0.11%～2.04%，相對峰面積的RSD 為0.15%～2.47%，相似度＞0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取藥材粉末（S3）約2.5 g，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以東莨菪內(nèi)酯為內(nèi)參峰。結果，各主要共有峰相對保留時間的RSD 為0.09%～2.28%，相對峰面積的RSD為0.11%～2.53%，相似度＞0.99，表明本方法重復性良好。

2.4 數(shù)據(jù)分析方法[6-7]

利用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A 版）進行HPLC 指紋圖譜相似度分析；采用SPSS 17.0軟件進行主成分分析和聚類分析。

2.5 樣品測定

分別取青蒿飲片粉末（S1～S12，過40 目篩）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1、圖2。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）軟件，以S1為參照圖譜，經(jīng)多點校正，中位數(shù)法生成青蒿對照指紋圖譜[8]，從中篩選出16個主要特征指紋峰，并對5、14、16 號色譜峰進行指認，分別為東莨菪內(nèi)酯、青蒿素、青蒿酸。

圖1 青蒿樣品高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of A.apiacea samples

圖2 對照品重疊空白甲醇色譜圖a.青蒿素；b.青蒿酸；c.空白溶液；d.東莨菪內(nèi)酯Fig 2 Overlapping chromatograms of referencesa.artemisinin；b.artemisinic acid；c.blank solution；d.scopoletin

2.6 相似度計算

根據(jù)生成的對照指紋圖譜，計算各批樣品的相似度。結果，除S11與對照圖譜相似度為0.460外，其余各批樣品相似度均在0.962～0.998之間，其中S1、S6、S7、S8、S10、S12與對照圖譜相似度達到0.996以上?？梢?，不同批次樣品之間存在一定差異。

2.7 主成分分析和聚類分析

2.7.1 主成分分析 將12 批青蒿飲片色譜數(shù)據(jù)，以各樣品總峰個數(shù)、共有峰占總峰面積比值、與對照圖譜相似度及各樣品3 個主要特征峰（1.東莨菪內(nèi)酯；2.青蒿素；3.青蒿酸）與S1中各特征峰峰面積比值為數(shù)據(jù)源，形成6個樣本數(shù)據(jù)矩陣[6]，詳見表2。運用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)矩陣進行KMO 檢驗和Bartlett球形檢驗。結果，KMO統(tǒng)計量（0.689）＞0.5，Bartlett球形檢驗P＜0.05，表明各指標間相互獨立，適用于主成分分析。取特征值較大的兩個主成分（方差貢獻率為91.37%），以各樣品的得分建立坐標系，詳見圖3。由圖3 可知，S6、S7、S8，S5、S10、S9分散相對集中，說明S6、S7、S8之間，S5、S10、S9之間成分種類和含量相接近，而S11 與其他樣品距離相對較遠，因此S11 可排除建立共有模式所需樣品之外。

表2 數(shù)據(jù)矩陣表Tab 2 Data matrix table

圖3 青蒿樣品主成分分析圖Fig 3 Principal component analysis of A.apiacea samples

2.7.2 聚類分析 將不同批次青蒿樣品HPLC圖譜中的16個共有峰的峰面積值標準化，組成12×16 階數(shù)據(jù)矩陣[9]，運用SPSS 17.0軟件以組間聯(lián)接聚類法、歐氏平方距離法[6]作為測量的距離變量，并對其進行聚類分析，詳見圖4。

圖4 青蒿樣品聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis of A.apiacea samples

聚類結果表明，以虛線α為界，可以將12 批樣品聚類為兩大類：S11單獨聚為一類，其余11批樣品聚為另一類；以虛線β為界，可以將其聚為三大類：S11聚為一類，S1、S12、S3、S2、S4聚為一類，其余為一類；以虛線γ為界，可以將其聚為四大類：Ⅰ（S6、S7、S8、S5、S10、S9），Ⅱ（S2、S4），Ⅲ（S1、S12、S3），Ⅳ（S11）。根據(jù)以上聚類結果，樣品S6、S7、S8、S5、S10、S9 聚為一類，說明它們之間具有一定的統(tǒng)一性。其中，Ⅰ類中S7、S8、S6聚為一類，S9、S10、S5聚為一類，表明同一類別中飲片又存在一定的差異性。同樣，S12、S1聚為一類后又與S3聚為一類形成Ⅲ，說明它們之間既存在一定的統(tǒng)一性又存在一定的差異性；S11 單獨聚為一類，說明S11 與其他批次樣品之間差別顯著，分析原因可能與青蒿藥材的栽培、飲片加工和存放等多種因素有關，或企業(yè)自身飲片生產(chǎn)過程不規(guī)范，存在摻假摻雜等問題?？梢姡煌惺埏嬈g存在一定差異，聚類分析對青蒿進行化學模式識別具有一定的科學道理，與主成分分析結果相吻合。

2.8 青蒿標準HPLC指紋圖譜的建立

根據(jù)相似度計算結果，參考主成分分析和聚類分析結果，將S11以外的其余11批青蒿樣品AIA格式數(shù)據(jù)文件再次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A 版）軟件，以S1為參照圖譜，經(jīng)多點校正，中位數(shù)法生成青蒿HPLC 指紋圖譜和對照指紋圖譜[8]，詳見圖5、圖6。

圖5 11批樣品的高效液相色譜指紋圖譜Fig 5 HPLC fingerprint of 11 batches of samples

圖6 對照指紋圖譜a.東莨菪內(nèi)酯；b.青蒿素；c.青蒿酸Fig 6 Reference fingerprinta.scopoletin；b.artemisinin；c.artemisinic acid

經(jīng)計算，11 批樣品的相似度分別為0.998、0.996、0.996、0.990、0.992、0.997、0.998、0.995、0.994、0.997、0.998，均在0.990以上，表明各批飲片之間相似性高，差異性小，間接說明重慶市售青蒿飲片質(zhì)量雖然存在一定差異性，但總體質(zhì)量較好。

3 討論

3.1 提取條件的考察

本試驗考察了不同提取溶劑（水、甲醇、50%乙醇和95%乙醇），比較了超聲提取、加熱回流、冷浸等不同提取方法，結果表明，以95%乙醇回流提取法2 h提取率較高。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

筆者嘗試了分別以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水等為流動相的分離效果，結果以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相進行全波長掃描，在220 nm波長處色譜峰數(shù)目較多，經(jīng)梯度洗脫程序洗脫后，峰形、出峰時間和分離效果相對較好。

3.3 12批飲片的質(zhì)量評價

根據(jù)相似度計算結果，12 批青蒿飲片中有1 批相似度過低，該分析結果與主成分分析和聚類分析結果相同，其余11批飲片之間相似性較高、差異性較小，化學成分種類和含量接近，間接說明重慶市售青蒿飲片質(zhì)量總體較好。個別樣品存在質(zhì)量問題，這可能與青蒿藥材的栽培、飲片加工和存放等多種因素有關，也不排除不法商販以假充真，以次充好的可能性，具體原因有待深入研究。為解決此問題，相關部門仍應著重加大對青蒿藥材種植，飲片加工、貯存方式的監(jiān)督管理，以保證良好的藥材、飲片供應。

（致謝：重慶市中藥研究院中藥種植研究所李隆云研究員對青蒿飲片進行了鑒別）

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