HPLC法測(cè)定蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4中庚酮類(lèi)成分的含量Δ

信莎莎，楊 洋，孫國(guó)園，董 玉（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010059）

蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4的法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（蒙藥分冊(cè)）》[1]。其處方由高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲（質(zhì)量比為4∶2∶1∶1）四味藥材組成，具有鎮(zhèn)“巴達(dá)干赫依”、消喘止痛的功能，可用于治療膈肌痙攣、胸悶氣短、胸肋刺痛、消化不良等癥。高良姜主要含有黃酮類(lèi)及庚烷類(lèi)化合物。本課題組前期對(duì)該藥進(jìn)行了分離與鑒定，并測(cè)定了其中黃酮類(lèi)成分的含量[2-4]。在此基礎(chǔ)上，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)前期分離純化得到的庚烷類(lèi)成分進(jìn)行定量測(cè)定，以為全面控制蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效成分的含量提供參考。

1 材料

1260型HPLC儀，包括梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器、柱溫箱、化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；AB135-S型超聲波清洗儀（瑞士Mettler-Toledo 公司）；BS224S 型電子分析天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)公司）。

1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮對(duì)照品（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制，純度：99%）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4中各味藥材均由內(nèi)蒙古天立藥材有限公司提供（經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院?jiǎn)炭±p教授鑒定為真品）。樣品共有4批（編號(hào)1～4）。其中，編號(hào)1：高良姜（批號(hào)：20140410），紫硇砂（批號(hào)：20140410），木香（批號(hào)：20140101），石菖蒲（批號(hào)：20140108）；編號(hào)2：高良姜（批號(hào)：20140426），紫硇砂（批號(hào)：20140410），木香（批號(hào)：20140101），石菖蒲（批號(hào)：20140108）；編號(hào)3：高良姜（批號(hào)：20140528），紫硇砂（批號(hào)：20140410），木香（批號(hào)：20140101），石菖蒲（批號(hào)：20140108）；編號(hào)4：高良姜（批號(hào)：20140707）；紫硇砂（批號(hào)：20140410）；木香（批號(hào)：20140101）；石菖蒲（批號(hào)：20140108）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Intersil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，45%A→55%A；25～40 min，55%A→100%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取經(jīng)減壓干燥至恒質(zhì)量的1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮對(duì)照品0.51 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方述達(dá)格-4樣品5.0 g，精密稱(chēng)定，置于100 ml 圓底燒瓶中，精密加入10 倍體積的50%乙醇，回流提取2次，每次2 h，趁熱用棉花粗濾，合并提取液，回收溶劑至無(wú)醇味，加蒸餾水稀釋至15 ml。后經(jīng)大孔樹(shù)脂柱，用2倍體積的水洗脫，棄去洗脫液，再用8倍體積的50%乙醇洗脫；收集洗脫液，回收溶劑，用70%乙醇定容于25 ml量瓶中，搖勻。精密量取上述溶液1.0 ml，置于25 ml量瓶中，用70%乙醇定容于25 ml量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按復(fù)方述達(dá)格-4 比例，制得不含高良姜的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1 可知，供試品中1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮色譜峰能達(dá)到有效分離，且保留時(shí)間與相應(yīng)對(duì)照品一致；陰性對(duì)照溶液在相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，表明其余藥味對(duì)1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substances；B.test samples；C.negative control；1.1-phenyl-7-（3-methoxy-4-hydroxy）phenyl-5-ol-3-heptanone

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2.0、6.0、10.0、14.0、16.0、20.0 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮回歸方程為y＝6 988.436 10x+63.950 60（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮進(jìn)樣量在0.102～1.02 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果，1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮峰面積的RSD 為0.50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（編號(hào)1）5.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮峰面積的RSD 為0.05%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（編號(hào)1）6 份，各5.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮的平均含量為3.421 3%，RSD 為1.52%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已恒質(zhì)量的干燥藥材粉末（編號(hào)1）6份，各2.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入一定量的1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Table 1Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取4 批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果4 批樣品的含量分別為3.421 3%、3.128 5%、2.848 5%、3.369 5%。

3 討論

3.1 待測(cè)成分的選擇

自1885年至今已發(fā)現(xiàn)并確立結(jié)構(gòu)的天然線(xiàn)性二苯基庚烷類(lèi)化合物共有67 個(gè)[5]。1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮為二芳基庚烷類(lèi)化合物，主要存在于姜科植物中，是一類(lèi)結(jié)構(gòu)比較特殊的化合物。蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4中主要藥材高良姜為姜科植物，文獻(xiàn)報(bào)道其主要成分有黃酮類(lèi)、二芳基庚烷類(lèi)及揮發(fā)油等[6]。有報(bào)道對(duì)二芳基庚烷類(lèi)及其單體進(jìn)行了相關(guān)的藥理研究[7]，發(fā)現(xiàn)1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮具有溫胃散寒和消食止痛的作用。本課題從復(fù)方整體出發(fā)，采用現(xiàn)代化手段，對(duì)復(fù)方的化學(xué)成分進(jìn)行研究，以確定與復(fù)方主治功能相一致的主要活性成分，并對(duì)其質(zhì)量控制方法進(jìn)行探討。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器，以本研究所用的流動(dòng)相為溶劑，在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該成分在200～210 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收，但在200 nm波長(zhǎng)末端吸收處信號(hào)干擾大，基線(xiàn)不平，故選取210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇中，筆者比較了甲醇-水、甲醇-0.5%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸水等為流動(dòng)相時(shí)的分離情況和出峰時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.5%磷酸水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫能使樣品峰達(dá)到良好分離，峰形對(duì)稱(chēng)。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用于蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4的質(zhì)量控制。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：蒙藥分冊(cè)[S].1998：158.

[2]楊洋，賈鑫，董玉，等.蒙藥述達(dá)格-4 的化學(xué)成分研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，44（4）：392.

[3]賈鑫，武娜，董玉.高效液相色譜法測(cè)定蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位中山柰素和高良姜素的含量[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（3）：225.

[4]馬強(qiáng)，賈鑫，董玉.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4中3種黃酮類(lèi)成分的含量[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，41（6）：665.

[5]羅京超，馮毅凡，吉星.天然線(xiàn)性二苯基庚烷類(lèi)化合物的研究進(jìn)展[J].中草藥，2008，39（12）：1 912.

[6]郭曉玲，孟青，馮毅凡，等.GC法測(cè)定高良姜醇提物中兩個(gè)二苯基庚烷類(lèi)化合物[J].中草藥，2011，42（8）：1 554.

[7]李洪福，李永輝，王勇，等.高良姜化學(xué)成分及藥理活性的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（7）：236.