頂空氣相色譜法測(cè)定胡黃連苷Ⅱ原料藥中7種有機(jī)溶劑殘留量

汪 斌，鄭 璐，姚仲青，李 鵬，薛 明，陳煒偉（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)中藥研究院，江蘇泰州 225321）

胡黃連苷Ⅱ（PicrosideⅡ）是從玄參科多年生植物胡黃連的干燥根莖中分離提純的環(huán)烯醚萜類化合物[1-2]，具有保肝利膽、抗菌抗炎、調(diào)節(jié)血脂的作用[3-4]。在胡黃連苷Ⅱ制備過(guò)程中，可能會(huì)殘留一定量的有機(jī)溶劑。為保證藥品質(zhì)量和用藥安全，應(yīng)嚴(yán)格限制制備過(guò)程中帶入的殘留溶劑含量。但目前有關(guān)胡黃連苷Ⅱ原料藥中有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。為此，筆者根據(jù)2010 版《中國(guó)藥典》（二部）中關(guān)于殘留溶劑測(cè)定法的指導(dǎo)原則[5]，采用頂空氣相色譜法[6]，對(duì)胡黃連苷Ⅱ原料藥中有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行了系統(tǒng)分析，建立了同時(shí)測(cè)定胡黃連苷Ⅱ原料藥中甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯和二乙烯苯7種溶劑量殘留的方法。

1 材料

7890B 型氣相色譜儀，包括7697A 型自動(dòng)頂空進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；GWA-UN2-C30型超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XS205Dual Range十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KH-700DB 型數(shù)控超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

胡黃連苷Ⅱ（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20140405-1、20140405-2、20140405-3，純度均＞96%）；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、苯、苯乙烯、二乙烯苯對(duì)照品（純度均＞99.5%），N-N二甲基甲酰胺（DMF）均購(gòu)至國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司均為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷（DB-624）為固定液的毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.80 μm）；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持10 min，以10 ℃/min 升溫至220 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）；溫度：250 ℃；載氣：高純氮?dú)?；載氣流速：35 ml/min；分流比：10∶1；頂空加熱溫度：85 ℃；平衡時(shí)間：45 min；頂空瓶裝樣量：5 ml；進(jìn)樣量：1 ml。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液 精密量取50%DMF 5 ml，置于20 ml頂空瓶中，加蓋密封，作為空白溶液。

2.2.2 對(duì)照品貯備液 取甲醇對(duì)照品300 mg、乙醇對(duì)照品500 mg、乙酸乙酯對(duì)照品500 mg、甲苯對(duì)照品90 mg，分別置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，得甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯對(duì)照品貯備液；精密稱取苯10 mg，置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，精密量取1 ml，置于50 ml量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，得苯對(duì)照品貯備液；精密稱取苯乙烯、二乙烯苯各20 mg，分別置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，分別精密量取1 ml，置于10 ml量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，得苯乙烯、二乙烯苯對(duì)照品貯備液。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液 分別精密量取上述對(duì)照品貯備液1 ml，置于同一100 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，搖勻，精密量取5 ml，置于20 ml頂空進(jìn)樣瓶中，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱取胡黃連苷Ⅱ0.25 g，置于頂空進(jìn)樣瓶中，精密加入50%DMF 5 ml，加蓋密封，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理5 min，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下空白溶液、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，空白溶液中的雜質(zhì)峰對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品貯備液各1 ml，置于同一25 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。分別精密量取混合對(duì)照貯備液0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00 ml，置于10 ml 量瓶中，分別加入50%DMF 溶解并定容；分別精密量取5 ml，置于頂空進(jìn)樣瓶中，按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍詳見(jiàn)表1。

圖1 氣相色譜圖A.空白溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.甲醇；2.乙醇；3.乙酸乙酯；4.苯；5.甲苯6.DMF溶液；7.苯乙烯；8～13.二乙烯苯Fig 1 GC chromatogramsA.blank solution；B.reference solution；C.test sample solution；1.methanol；2.ethanol；3.ethyl acenitrile；4.benzene；5.methylbenzene；6.DMF solution；7.phenylethylene；8-13.divinylbenzene

表1 回歸方程及線性范圍Tab 1 Regressive equations and linear ranges

2.5 檢測(cè)限及定量限[5]

以信噪比為3 計(jì)算甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的檢測(cè)限分別為0.05、1.12、0.02、12.62、5.16、1.40、450.00 ng/ml；以信噪比為10 計(jì)算甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的定量限分別為0.16、4.30、0.07、37.00、18.30、4.39、550.00 ng/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)下方法制備甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯質(zhì)量濃度分別為0.188、0.307、0.302、0.062 7 mg/ml，苯、苯乙烯、二乙烯苯質(zhì)量濃度分別為0.118、1.745、1.880 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，各成分峰面積的RSD 均小于3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140405-1）適量，于室溫（25 ℃）下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，各成分峰面積的RSD均小于3%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取胡黃連苷Ⅱ（批號(hào)：20140405-1）適量，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，再按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，各成分均未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：20140405-1）6 份，每份約0.25 g，置于各頂空進(jìn)樣瓶中。另按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備相當(dāng)于各對(duì)照品質(zhì)量濃度的100%的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取該標(biāo)準(zhǔn)溶液5 ml 加入盛有樣品的頂空進(jìn)樣瓶中，再按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery rate（n＝6）

2.10 樣品中有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定

取3 批樣品（20140405-1、20140405-2、20140405-3）各適量，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)一點(diǎn)定量法計(jì)算有機(jī)溶劑殘留量。結(jié)果，3批樣品均未檢出。

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)的確立

胡黃連苷Ⅱ原料藥在分離和純化過(guò)程中均使用了HPD-100 型大孔吸附樹脂及有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯，從用藥的安全性考慮，本試驗(yàn)對(duì)大孔樹脂可能引入的苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯及制備純化過(guò)程使用的甲醇、乙醇、乙酸乙酯的殘留量進(jìn)行控制。

3.2 溶劑的選擇

胡黃連苷Ⅱ中可能存在的殘留溶劑在50%DMF中溶解度較好，且DMF 沸點(diǎn)高，對(duì)其他峰的干擾較小。故將50%DMF作為本研究的溶劑。

3.3 色譜條件的選擇

本試驗(yàn)選擇頂空進(jìn)樣的方法，避免了樣品中難溶性物質(zhì)對(duì)色譜柱的污染；檢測(cè)的有機(jī)溶劑組分較多，極性差異大，筆者曾選用HP-5毛細(xì)管柱測(cè)定有機(jī)物殘留，發(fā)現(xiàn)各組分不能達(dá)到基線分離，且DMF對(duì)測(cè)定有干擾；選用DB-624毛細(xì)管柱，各組分均能獲得較好的分離，峰型較好，且DMF不影響測(cè)定。采用程序升溫的方式，使7 種有機(jī)溶劑達(dá)到了完全分離，且縮短了分析周期，提高了檢測(cè)效率。在加樣回收率試驗(yàn)中，甲醇、乙醇、乙酸乙酯及苯的沸點(diǎn)較低，甲苯、二乙烯苯沸點(diǎn)較高，加樣回收率較高；苯乙烯沸點(diǎn)較高，加樣回收率較低，但均符合氣相色譜要求[7-8]，且RSD均小于3.5%。

綜上所述，該方法專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于胡黃連苷Ⅱ原料藥有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定。

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