HPCE法測(cè)定水曲柳葉中荷包花苷A的含量Δ

陳玉娟，王 巍，李成玉，張佳佳，楊 業(yè)，李步步（長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

水曲柳（Fraxinus mandschuricaRupr.）屬木犀科梣屬植物，其樹(shù)皮具有抗炎鎮(zhèn)痛之功效[1]。近年來(lái)由于大量的砍伐，水曲柳資源日漸減少[2]，水曲柳皮也不易獲得。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其樹(shù)葉中主要成分除了香豆素類(lèi)，還含有苯乙醇苷類(lèi)等成分[3-4]。目前未見(jiàn)有關(guān)水曲柳葉中苯乙醇苷類(lèi)成分（如荷包花苷A）含量測(cè)定的報(bào)道。為此，筆者建立了水曲柳葉中荷包花苷A 的高效毛細(xì)管電泳（HPCE）含量測(cè)定方法，以為該藥材的新選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

G1600A 型毛細(xì)管電泳儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、1200色譜工作站（美國(guó)Agilent 公司）；JA12002型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；LE104E 型電子天平（美國(guó)Mettler-Toledo公司）；KQ-400KDE型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

荷包花苷A 對(duì)照品由本課題組從水曲柳皮中分離純化，經(jīng)核磁共振氫譜（1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-NMR）鑒定結(jié)構(gòu)[5]，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）峰面積歸一化法測(cè)定純度＞99%；硼酸鹽緩沖液（美國(guó)Agilent 公司，pH 9.3）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 藥材

水曲柳葉（共3 批，No1、No2、No3）采自長(zhǎng)白山，經(jīng)吉林大學(xué)張靜敏教授鑒定為真品，標(biāo)本存放于長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[7]

毛細(xì)管：未涂層熔融石英毛細(xì)管（50 cm×75 μm）；緩沖液：硼酸鹽緩沖鹽（20 mmol/L，pH 9.3）；分離電壓：20 KV；壓力進(jìn)樣（進(jìn)樣壓力為50 bar，進(jìn)樣時(shí)間為3 s）；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：30 ℃。開(kāi)機(jī)后依次用1 mol/LNaOH 沖洗5 min，水沖洗3 min，硼酸鹽緩沖液沖洗5 min，然后進(jìn)樣；每次進(jìn)樣之間用1 mol/LNaOH 沖洗1 min，水沖洗1 min，硼酸鹽緩沖液沖洗2 min。在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，理論板數(shù)以荷包花苷A峰計(jì)不低于3 000，各成分基線分離良好，詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效毛細(xì)管電泳圖A.對(duì)照品；B.供試品；1.荷包花苷AFig 1 HPCE chromatogramsA.reference substance；B.test sample；1.calceolarioside A

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取荷包花苷A 對(duì)照品5 mg，置于50 ml 量瓶中，用硼酸鹽緩沖液溶解并定容，得每1 ml 含荷包花苷A 0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取干燥的水曲柳葉5 g，加50 ml 80%乙醇浸泡30 min，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取3 次，每次10 min，濾過(guò)，濾液備用；殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并2次濾液，減壓濃縮得稠膏。稠膏加水100 ml 分散，再用100 ml 乙酸乙酯分3次萃??；萃取完的水液用水飽和正丁醇100 ml分3次萃取，合并正丁醇層，減壓回收正丁醇；剩余物用乙醇10 ml 溶解，取300 μl乙醇溶解液并加硼酸鹽緩沖液稀釋至1 ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品適量，加硼酸鹽緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 μg/ml的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以荷包花苷A質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝64.024x－144.58（r＝0.999 7，n＝6）。結(jié)果表明，荷包花苷A檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為50～250 μg/ml。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，荷包花苷A 峰面積的RSD為0.29%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（No.1）溶液適量，分別于放置0、2、4、6、8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，荷包花苷A峰面積的RSD為2.3%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批樣品（No.1）適量，共6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，荷包花苷A 峰面積的RSD 為2.4%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（No.1）適量，共6 份，分別加入一定質(zhì)量對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中制備供試品時(shí)，與傳統(tǒng)的加熱回流和冷浸法比較，超聲提取法效果好、用時(shí)短；采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，除去了極性較低成分的干擾。對(duì)水曲柳葉中荷包花苷A測(cè)定干擾最大的是香豆素類(lèi)成分，本試驗(yàn)通過(guò)以下兩個(gè)方面減少相關(guān)成分干擾：（1）選用350 nm的檢查波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下，荷包花苷A有最大吸收，而香豆素類(lèi)成分吸收相對(duì)較弱；（2）在pH 9.3硼酸鹽緩沖液中，含量最多的白蠟樹(shù)精苷呈中性，與溶劑峰的保留時(shí)間一致，在6.6 min左右出峰；荷包花苷A可在此緩沖鹽溶液中電離成負(fù)離子，在11 min左右出峰，所以避免了白蠟樹(shù)精苷的干擾。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

文獻(xiàn)中測(cè)定苯乙醇苷含量多采用HPLC 法[8-10]，與HPLC法比較，HPCE 法不僅同樣具有快速分析的特點(diǎn)，并且操作更簡(jiǎn)單，而且所用緩沖液便宜易得、無(wú)毒、用量少。

綜上所述，該法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于測(cè)定水曲柳葉中荷包花苷A的含量。

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