HPLC法測定中藥愈傷便捷濕巾藥液中梔子苷的含量Δ

楊璐璐，秦學(xué)玲，彭 靜，寧亞功（.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院中醫(yī)科，昆明 65003；.云南省食品藥品檢驗所，昆明 6500）

中藥愈傷便捷濕巾是由梔子、白及、馬勃等藥材提取精制成藥液，以濕巾為載體的一種含藥濕巾，為外用中藥制劑；具有消腫鎮(zhèn)痛、止血愈傷的功效，可用于軟組織扭挫傷所致的腫痛及創(chuàng)傷出血，使用時將濕巾敷于患處即可。中藥愈傷便捷濕巾具有使用方便、費用低廉、易于保存、利于自救互救的特點。梔子是方中君藥，本方主要取梔子涼血解毒、清熱利濕的功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，梔子中含40余種生物活性物質(zhì)，主要為環(huán)烯醚萜類和揮發(fā)油類；而國內(nèi)外公認的梔子有效成分為環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，其中含量最高的為梔子苷。梔子苷具有抗炎和一定的鎮(zhèn)痛作用。此外，梔子苷還具有抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤等作用[1-2]。梔子苷也是梔子質(zhì)量檢測的法定指標(biāo)成分[3]。目前中藥愈傷便捷濕巾中梔子苷的含量測定尚未見文獻報道，為此本研究采用高效液相色譜（HPLC）法測定中藥愈傷便捷濕巾中梔子苷的含量，以為中藥愈傷便捷濕巾的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 型HPLC 儀（日本島津公司）；TB-215D 型電子天平（美國丹佛儀器有限公司）；UE10SFD型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）。

1.2 藥品與試劑

中藥愈傷便捷濕巾藥液（成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院自制，批號：20130816、20130817、20130818）；梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-200714，純度：100%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（10∶90，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：236 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取梔子苷對照品0.010 41 g，加甲醇制成每1 ml含梔子苷0.208 2 mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取中藥愈傷便捷濕巾藥液2 ml，置于具塞錐形瓶中，蒸干；精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml，置于25 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密量取5 ml，置于50 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.梔子苷對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.梔子苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.geniposide

2.2.3 陰性對照溶液 取除梔子外的其他處方藥材各適量，按中藥愈傷便捷濕巾藥液制備工藝制成缺梔子的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取梔子苷對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加甲醇定容，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以進樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得梔子苷的回歸方程為y＝2 964.8x+31.615（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，梔子苷的檢測進樣量線性范圍為0.104 1～1.041μg。

2.4 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下對照品溶液10 μl 注入HPLC 儀，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD為0.23%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液（批號：20130816）適量，分別于放置0、2、4、8、16 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD為0.48%（n＝5），表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號：20130816）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD為0.07%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的同一批（批號：20130816）樣品6 份，每份1 ml，分別精密加入一定量的梔子苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測定

取3批中藥愈傷便捷濕巾藥液樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

本試驗曾選用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸作為流動相，并調(diào)節(jié)流動相的比例，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸（10∶90，V/V）為流動相[4-8]時分離效果佳、峰形好、基線較穩(wěn)定。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/ml）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/ml）

梔子苷對照品溶液理論上在238 nm波長處吸收較強[3]，而實際中供試品溶液中梔子苷在236 nm 波長處響應(yīng)值最大，且干擾較小，故選擇236 nm為檢測波長。

本試驗考察了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果兩種方法提取效率相當(dāng)，由于超聲提取法具有效率高、操作簡便等優(yōu)點，所以采取超聲提取法[4-10]；本試驗還考察了以甲醇、不同比例的甲醇-水為提取溶劑，結(jié)果甲醇提取效果較好、雜質(zhì)成分少，所以采用甲醇為提取溶劑；本試驗亦考察了超聲提取時間20、30、40、60 min，結(jié)果超聲提取20、30、40、60 min提取效率相當(dāng)，故確定超聲提取時間為20 min。

綜上所述，本試驗所建立的方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于中藥愈傷便捷濕巾藥液中桅子苷的含量測定。

[1]游偉良，平其能，孫敏捷，等.梔子苷的藥理學(xué)研究新進展[J].藥學(xué)進展，2012，36（4）：158.

[2]吳虹，魏偉，宋禮華，等.梔子總苷的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（7）：31.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：2 131.

[4]孟憲波.HPLC測定蓮梔清火膠囊中梔子苷、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（14）：155.

[5]筆雪艷，劉曉鳳，張清波，等.HPLC法測定清開靈泡騰片中梔子苷的含量[J].中國藥房，2011，22（3）：240.

[6]張留記，劉欽松，屠萬倩，等.RP-HPLC 法同時測定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷、西紅花苷-Ⅷ和西紅花苷-Ⅷ的含量[J].中國藥房，2011，22（7）：630.

[7]李延雪，王云龍，邵禮梅，等.高效液相色譜法同時測定耳聾通竅丸中龍膽苦苷和梔子苷含量[J].中國藥業(yè)，2012，21（20）：45.

[8]張勇，薛昆鵬，何美，等.固相萃取/超高效液相色譜法測定龍膽瀉肝丸中梔子苷、龍膽苦苷與黃芩苷[J].分析測試學(xué)報，2013，32（1）：122.

[9]朱繼孝，羅光明，陳巖，等.梔子質(zhì)量的化學(xué)模式識別研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（11）：2 628.

[10]游劍，鄧青云，高麗，等.不同工藝對梔子苷提取效果的比較研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（1）：220.