一株NSP2蛋白連續(xù)缺失48個(gè)氨基酸的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的分離及其主要生物學(xué)特征的研究

白 云，劉益民，陳家锃，張洪亮，張秋月，王 倩，張武超，葉 超，彭金美，安同慶，童光志，田志軍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS 病毒(PRRSV)引起的，能夠感染處于不同生長(zhǎng)期的豬，主要導(dǎo)致妊娠母豬后期流產(chǎn)、仔豬或保育豬呼吸困難，易繼發(fā)細(xì)菌感染或與其它病毒共同感染，造成豬消瘦甚至死亡。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是威脅生豬養(yǎng)殖業(yè)的重大傳染病之一。該病毒可分為兩個(gè)基因型即歐洲型和美洲型，分別以LV 和VR2332 株為代表[1-2]，我國(guó)以美洲型PRRSV 的流行為主[3-5]。PRRSV具有變異較快的特征，其Nsp2 基因是高度可變的，主要體現(xiàn)在氨基酸的插入和缺失，這也成為區(qū)分不同病毒株的重要標(biāo)志。尤其是2006 年我國(guó)發(fā)生了高致病性PRRS(HP-PRRS)，經(jīng)鑒定其病原HP-PRRSV的代表株與CH-1a 的同源性僅為95 %，與VR2332株的同源性為89 %，其顯著特征為在其NSP2 區(qū)存在30 個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失[6-7]。

本研究中，我們從某疑似PRRS 發(fā)病的仔豬體內(nèi)分離到一株P(guān)RRSV，該分離株 為HP-PRRSV，其NSP2 區(qū)在1 aa+29 aa 缺失的基礎(chǔ)上，突變?yōu)?9 aa+29 aa 的缺失株，將其命名為Henan-A14。本研究對(duì)該分離株的分子及生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，并利用反向遺傳技術(shù)著重研究了其NSP2 區(qū)48 aa 缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及臨床樣品 HP-PRRSV 疫苗株HuN4-F112 及免疫HP-PRRSV 活疫 苗(HuN4-F112 株)仔豬制備的具有中和活性的血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；PRRSV HuN4-F112 株的感染性克隆質(zhì)粒由張善瑞博士惠贈(zèng)；抗PRRSV M 蛋白單克隆抗體(MAb)由本實(shí)驗(yàn)室制備；FITC 標(biāo)記羊抗鼠IgG(IgG-FITC)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。病料樣品來(lái)自于河南某規(guī)?；i場(chǎng)，該豬場(chǎng)有部分仔豬疑似PRRS 發(fā)病。

1.2 病毒的分離鑒定及測(cè)序 病料樣品研磨后以PBS 稀釋，過(guò)濾除菌，取上清液接種于肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中，培養(yǎng)48 h，取上清液接種下一代PAM細(xì)胞中，盲傳5 代。提取最后一代接毒的PAM 細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，利用9 對(duì)引物對(duì)病毒全基因組分段PCR 擴(kuò)增(如讀者需要相關(guān)引物信息，作者可以提供)。將這些基因片段進(jìn)行測(cè)序、拼接、比對(duì)分析。

1.3 NSP2編碼區(qū)48 aa缺失病毒株的感染性克隆的構(gòu)建 利用重疊延伸PCR(SOE-PCR)進(jìn)行靶序列的缺失，具體過(guò)程如下：在靶序列缺失區(qū)兩端設(shè)計(jì)4 條引物(Primer1-4)，下游引物Primer 2 和上游引物Primer 3 存在彼此互補(bǔ)的部分(設(shè)計(jì)引物時(shí)互補(bǔ)的部分不包含目的缺失區(qū))，進(jìn)行兩輪PCR 反應(yīng)，第一次PCR 時(shí)擴(kuò)增出兩條片段，以其為模板，以Primer 1 和4 為引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)片段。目的基因逐步克隆至感染性克隆pHuN4-F112 中(圖1)，測(cè)序鑒定。

圖1 感染性克隆質(zhì)粒pHuN4-F112-D48 的構(gòu)建Fig.1 Construction of the infectious clone pHuN4-F112-D48

1.4 缺失病毒的拯救 病毒拯救的步驟按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行[8]。使用限制性內(nèi)切酶SwaⅠ將感染性克隆質(zhì)粒線性化，以其為模板轉(zhuǎn)錄為RNA。將純化后的RNA 轉(zhuǎn)染到BHK-21 中，培養(yǎng)24 h 后，取200 μL 上清液感染MARC-145 細(xì)胞，至出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)后，通過(guò)間接免疫熒光(IFA)、RT-PCR 和測(cè)序的方法鑒定重組病毒。

1.5 缺失病毒特性的鑒定

1.5.1 缺失病毒的IFA 鑒定 在病毒接種后的48 h，以預(yù)冷的丙酮將部分接種病毒的細(xì)胞固定于8 孔載玻片上，以抗PRRSV M 蛋白MAb 為一抗，羊抗鼠IgG-FITC 為二抗進(jìn)行IFA 鑒定。

1.5.2 病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將100 TCID50的病毒感染培養(yǎng)于24 cm2的細(xì)胞瓶中MARC-145 細(xì)胞。感染后以12 h 為起點(diǎn)，每隔12 h 取300 μL 細(xì)胞上清液，接種培養(yǎng)于96 孔培養(yǎng)板中的MARC-145 細(xì)胞單層中，采用Reed-Muench 法計(jì)算病毒的TCID50，依據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)病毒的滴度變化繪制出病毒的生長(zhǎng)曲線。

1.5.3 血清交叉中和試驗(yàn)鑒定 采用終點(diǎn)法中和試驗(yàn)，固定病毒稀釋血清法檢測(cè)HP-PRRSV 陽(yáng)性抗血清對(duì)分離株的中和效價(jià)[9]，同時(shí)以疫苗株HuN4-F112 作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離鑒定 將病料樣品研磨后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，利用針對(duì)PRRSV NSP2和GP5 區(qū)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性。將病料樣品接種于PAM 細(xì)胞中連續(xù)傳代5次進(jìn)行純化，經(jīng)IFA 鑒定所分離純化的病毒為一株P(guān)RRSV。

2.2 全基因組測(cè)序分析 對(duì)分離株的全基因組序列分段擴(kuò)增測(cè)序，拼接為全長(zhǎng)15 194 nt 的序列。通過(guò)DNAStar 軟件分析顯示，與經(jīng)典毒株CH-1a 相比，該分離株在HP-PRRSV NSP2 區(qū)1 aa+29 aa 缺失的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步缺失為49 aa+29 aa 的缺失株(圖2)，將其命名為Henan-A14。通過(guò)與其它病毒株進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析顯示，在HP-PRRSV 09HUB2 和YN9株中也存在類似的缺失，但該分離株缺失范圍更大(表1)。進(jìn)化樹分析顯示，該分離株與HP-PRRSV JXA1、HuN4 等均位于共同的分支，屬于HP-PRRSV。但相比較而言，該分離株位于基因進(jìn)化樹最末端，與JXA1 和HuN4 的基因距離均較遠(yuǎn)，表明其基因組發(fā)生了較大的變異(圖3)。

圖2 不同病毒株間NSP2 蛋白序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of NSP2 from different PRRSV strains

表1 不同PRRSV 病毒株間NSP2 蛋白缺失的大小與位置Table 1 Deletions in the NSP2 proteins of several PRRSV strains

圖3 Henan-A14 與13 株美洲型PRRSV 全基因序列進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the whole genome among North American PRRSV

同源性分析表明，分離株與經(jīng)典代表株VR2332、CH-1a、BJ-4 和SHB 的同源性為87.3 %～92.5 %，與高致病性代表株同源性相對(duì)較高，但也僅約為96 %，即使是具有相似缺失位置的09HUB2和YN9 株，同源性也僅為96.3 %和96.7 %，表明其與09HUB2、YN9 的關(guān)聯(lián)性可能不高，3 者可能是獨(dú)自變異形成的。通過(guò)對(duì)基因組各個(gè)開放閱讀框(ORF)比對(duì)，其ORF2a 和ORF3 是分離株中變異最大的ORF。

2.3 PRRSV NSP2基因區(qū)49 aa+29 aa缺失感染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救 為研究NSP2 區(qū)48 aa 缺失的影響，以感染性克隆質(zhì)粒pHuN4-F112 為骨架，利用SOE-PCR 的方法，將其相應(yīng)的區(qū)域缺失，篩選得到相應(yīng)位點(diǎn)核酸缺失的重組感染性質(zhì)粒。經(jīng)病毒拯救，缺失病毒在MARC-145 中傳代，出現(xiàn)明顯的CPE；IFA 鑒定，觀察到特異性熒光(圖4)。RTRCR 擴(kuò)增病毒的NSP2 區(qū)，NSP2 基因測(cè)序證明缺失病毒拯救成功，將其命名為rHuN4-F112-D48。

圖4 IFA 鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of the rescued virus with MAb against PRRSV M protein by IFA

2.4 連續(xù)48 aa缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響 在MARC-145 細(xì)胞單層中分別檢測(cè)HuN4-F112、Henan-A14 及rHuN4-F112-D48 3 株病毒動(dòng)態(tài)病毒滴度的變化，并繪制其生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，Henan-A14 在MARC-145 細(xì)胞中生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，明顯低于HuN4-F112 的3～4 個(gè)滴度，缺失了48 aa 的嵌合病毒rHuN4-F112-D48 的生長(zhǎng)曲線與HuN4-F112 無(wú)顯著差異，表明該區(qū)域未影響病毒的復(fù)制(圖5)。

2.5 Henan-A14株的中和抗原特性及連續(xù)48 aa缺失對(duì)病毒中和表位的影響 利用疫苗株HuN4-F112免疫仔豬制備的血清對(duì)Henan-A14 株進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果這5 份血清幾乎均不能夠中和Henan-A14(表2)，表明Henan-A14 的中和抗原與疫苗株存在較大的差別。而5 份血清對(duì)rHuN4-F112-D48 的中和效價(jià)與HuN4-F112 沒有顯著差異，表明Henan-A14 的NSP2 區(qū)48 aa 的缺失同樣也不影響病毒的中和表位區(qū)。

圖5 不同病毒株在MARC-145 細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Viral growth property of different PRRSVs in MARC-145 cells

表2 5 份血清針對(duì)不同毒株的交叉中和效價(jià)Table 2 Virus neutralization titers of 5 anti-sera against the PRRSVs

3 討論

PRRSV 屬于RNA 病毒，由于其RNA 酶的保真性較差，所以其基因組較容易發(fā)生變異[10]。本研究對(duì)新分離的PRRSV Henan-A14 株序列分析表明，雖然其分子特征上仍屬于HP-PRRSV，但其基因組與代表株JXA1、HuN4 和TJ 相比發(fā)生了大約540 個(gè)堿基的置換或突變，導(dǎo)致其與HP-PRRSV 代表株相比同源性僅約為96.5 %。由于PRRSV 經(jīng)典株CH-1a與HP-PRRSV 之間的同源性僅約為95%，存在3.5%的差異，反映了該分離株可能存在較大的異質(zhì)性，并導(dǎo)致其生物學(xué)特性的改變。

本研究中對(duì)分離株細(xì)胞嗜性的分析發(fā)現(xiàn)其在MARC-145 細(xì)胞中的復(fù)制能力降低。在病毒分離中我們也發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的HP-PRRSV 分離株不適宜在MARC-145 細(xì)胞中進(jìn)行分離和增殖，由于PRRSV 活疫苗株的致弱和疫苗的制備過(guò)程中，均需要在MARC-145 細(xì)胞中進(jìn)行傳代，因此這種現(xiàn)象需要引起足夠的重視。此外，實(shí)驗(yàn)還顯示由疫苗株誘導(dǎo)的中和抗體對(duì)分離株交叉中和效價(jià)低，表明其中和抗原與HP-PRRSV HuN4 株差別較大。分離株的細(xì)胞嗜性和抗原異質(zhì)性可能是由多基因突變?cè)斐傻模@也對(duì)PRRSV 的研究提出了更多的挑戰(zhàn)。

由于分離株的NSP2 區(qū)存在更大的連續(xù)缺失，而NSP2 與病毒的復(fù)制有關(guān)[11-13]，研究證明NSP2 可以存在于病毒粒子的表面，表明其也是結(jié)構(gòu)蛋白的一部分[14]。為研究該缺失的功能，本研究構(gòu)建NSP2相應(yīng)區(qū)域的氨基酸缺失的突變體病毒，分析其生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，缺失其48 aa 后并未影響病毒的復(fù)制，表明該缺失區(qū)域是PRRSV 的生長(zhǎng)非必需區(qū)。

總之，拯救的缺失病毒在MARC-145 細(xì)胞中的復(fù)制及血清中和試驗(yàn)生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明，NSP2 基因區(qū)48 aa 缺失即不影響PRRSV 的復(fù)制效率，也不影響病毒對(duì)HP-PRRSV 制備的陽(yáng)性血清中和效率。本研究的結(jié)果證明Henan-A14 分離株在MARC-145細(xì)胞中復(fù)制能力的降低，以及病毒抗原中和表位與NSP2 中相關(guān)的氨基酸缺失無(wú)直接關(guān)系。因此，Henan-A14 分離株這兩種重要的生物學(xué)特性的變異主要是由其他基因的變異所引起，并需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。本研究分離到一株基因組發(fā)生較大變異的PRRSV，其生物學(xué)特性發(fā)生了較大改變，尤其是其細(xì)胞嗜性的改變需要加強(qiáng)重視，本研究對(duì)PRRSV 的變異研究具有一定的價(jià)值。

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