不同培養(yǎng)液對鼠胚在新建試管嬰兒實驗室中體外發(fā)育的影響

饒金鵬 劉青 錢小紅 魏凱 陳劍 金敏 金帆

不同培養(yǎng)液對鼠胚在新建試管嬰兒實驗室中體外發(fā)育的影響

饒金鵬 劉青 錢小紅 魏凱 陳劍 金敏 金帆

目的利用三種不同的培養(yǎng)液EBSS(SIGMA系列), G1和G2(Vitrolife系列), Quinn’s1026和Quinn’s1029(SAGE系列)對昆明系小白鼠胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng), 以對新建IVF實驗室進(jìn)行評估。方法取7周齡的昆明白雌性小鼠, 用人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)10 IU促排卵,48 h后注射人絨毛促性腺激素(HCG)10 IU促卵泡成熟, 同時與雄性小鼠1：1合籠, 再經(jīng)過48 h后獲取形態(tài)正常的2細(xì)胞鼠胚。將胚胎分成三組, A組使用EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)培養(yǎng)液, B組使用G1和G2培養(yǎng)液, C組使用Quinn’s1026和Quinn’s1029培養(yǎng)液, 三種培養(yǎng)液均添加10％人血清白蛋白。分析對比三組結(jié)果。結(jié)果72 h后, 鼠胚總體囊胚形成率為71.54％(382/534), 其中A組的囊胚形成率為30.56％(22/72), B組為70.49％(129/183), C組為82.80％(231/279), B、C組的囊胚形成率顯著高于A組(P＜0.01)。結(jié)論通過鼠胚體外培養(yǎng), 對新建試管嬰兒實驗室進(jìn)行了較好的質(zhì)控檢測, 序貫培養(yǎng)液Vitrolife 系列的G1和G2以及SAGE系列的Quinn’s1026和Quinn’s1029在鼠胚囊胚形成率上要高于簡單培養(yǎng)液EBSS。

培養(yǎng)液；鼠胚；囊胚；體外培養(yǎng)；質(zhì)量控制

自1985年Ackerman等首先用2細(xì)胞鼠胚來對實驗室進(jìn)行質(zhì)量控制(quality control, QC), 鼠胚實驗(mouse embryo assay, EMA)已成為生殖醫(yī)學(xué)中心胚胎培養(yǎng)室質(zhì)量評估, 尤其是培養(yǎng)液質(zhì)量檢測最為廣泛應(yīng)用的方法[1]。而培養(yǎng)液對體外胚胎培養(yǎng)的重要性是不言而喻的, 一種優(yōu)化的培養(yǎng)系統(tǒng)可以支持胚胎在體外或移植后形成囊胚并繼而發(fā)育成胎兒[1,2]。旨在對新建IVF胚胎培養(yǎng)室進(jìn)行質(zhì)量控制, 同時對培養(yǎng)液進(jìn)行評估, 在為將來開展人類胚胎體外培養(yǎng)時培養(yǎng)液的選擇使用上積累實驗數(shù)據(jù), 本院生殖中心2014年9～12月使用3種不同培養(yǎng)液對昆明系小白鼠進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng), 并對比分析了3個不同組別之間的4細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞胚胎、融合胚以及囊胚形成率?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物7周齡雌性昆明系小白鼠(體質(zhì)量30～35 g),10周齡雄性小鼠(體質(zhì)量35～40 g), 均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心, 雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物與試劑 尿促性素(HCG)與絨促性素(HMG)均購自麗珠制藥廠。簡單培養(yǎng)液EBSS購自SIGMA公司, 序貫培養(yǎng)液G1和G2以及配子處理液G-GAMETE購自Vitrolife公司, 序貫培養(yǎng)液Quinn’s1026和Quinn’s1029, 人血清白蛋白(HSA)以及石蠟油均購自SAGE公司。培養(yǎng)液均添加10％HAS, 表面覆油后置于37℃,6.0％培養(yǎng)箱中平衡過夜。

1.1.3 耗材與設(shè)備35 mm培養(yǎng)皿及巴斯德管均購自美國FALCON公司, CO2氣體純度為99.999％, 丹麥IVFTECH工作站, 日本OLYMPUS解剖顯微鏡, 美國THEMRO培養(yǎng)箱, 德國LABTECH CO2濃度檢測儀, 美國SIGMA培養(yǎng)箱專用溫度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠胚獲取與培養(yǎng) 雌鼠腹腔注射10 IU的HMG,48 h后再注射HCG, 注射后立即將雌雄按1∶1的比例合籠,48 h后取胚。將孕鼠頸椎脫臼處死后用眼科剪取輸卵管放于覆油的G-GAMETE配子處理液中, 用1 ml注射器針頭將輸卵管切割數(shù)次, 擠出胚胎, 再用拉細(xì)的巴斯德管將2細(xì)胞鼠胚收集并隨機分裝到覆油的3種不同培養(yǎng)液中, 并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[3,4]。當(dāng)胚胎培養(yǎng)到8細(xì)胞階段, A組將胚胎轉(zhuǎn)移到新配制并于前1 d過夜平衡后的EBSS培養(yǎng)液, B、C組則分別將胚胎從G1和Quinn’s1026培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移到經(jīng)過夜平衡后的G2和Quinn’s1029培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 鼠胚的觀察 觀察并記錄24 h后4細(xì)胞胚胎形成率,48 h后8細(xì)胞或融合胚形成率,72 h后囊胚形成率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在2014年9～12月本院新建IVF胚胎實驗室共進(jìn)行7個周期的鼠胚體外培養(yǎng)實驗, 累計獲取2細(xì)胞胚胎534枚,其中形成囊胚382枚, 總體囊胚形成率為71.54％。鼠胚培養(yǎng)分成3個組別進(jìn)行, A組使用EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)簡單培養(yǎng)液, 在所獲得的72枚2細(xì)胞胚胎中共有22枚最終發(fā)育成囊胚, 囊胚形成率為30.56％；B組使用G1和G2序貫培養(yǎng)液,183枚2細(xì)胞胚胎中,129枚發(fā)育成囊胚,形成率為70.49％；C組使用Quinn’s1026和Quinn’s1029序貫培養(yǎng)液, 所得279枚胚胎中有231枚發(fā)育到囊胚階段, 其形成率為82.80％。B組和C組的囊胚形成率顯著高于A組(P＜0.01), 三組的胚胎發(fā)育情況及囊胚形成率, 見表1。鼠胚于覆油35 mm皿中體外培養(yǎng)不同時期的生長情況, 見圖1。

表1 不同培養(yǎng)液對鼠胚發(fā)育在各個分裂階段的影響(n, ％)

圖12 -細(xì)胞鼠胚于35 mm培養(yǎng)皿覆油培養(yǎng)的發(fā)育圖

3 討論

實驗室質(zhì)控對試管嬰兒結(jié)局有重要影響。體外一系列因素如溫度、濕度、塵埃、揮發(fā)性有機物(VOC)、震動、噪音、光照、CO2濃度、pH、滲透壓等都會對不具備任何屏障和保護(hù)功能的胚胎產(chǎn)生影響[1]。因此, 建立穩(wěn)定可靠的試管嬰兒實驗室, 為胚胎發(fā)育提供相對穩(wěn)定的場所, 維持試管嬰兒成功率顯得尤為重要。而在諸多影響胚胎發(fā)育的因素中, 培養(yǎng)液是直接和胚胎接觸的介質(zhì), 同時也是實驗室最常用及最重要的消耗品, 其穩(wěn)定性直接決定著胚胎培養(yǎng)的結(jié)局。小鼠胚胎生物檢測(MEA)是目前廣泛用于新建或新啟動周期的試管嬰兒實驗室的質(zhì)控方法, 尤其在評估培養(yǎng)液的質(zhì)量上發(fā)揮重要作用。

為了檢測新建試管嬰兒胚胎培養(yǎng)室是否達(dá)到人類胚胎培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn), 同時為今后開展試管嬰兒胚胎體外培養(yǎng)在培養(yǎng)液的選擇使用上積累實驗數(shù)據(jù), 本院生殖中心2014年9～12月,分別用EBSS, G1/G2, Quinn’s1026/1029對小鼠胚胎進(jìn)行了體外培養(yǎng), 并進(jìn)行了對比分析。鼠胚發(fā)育的結(jié)果顯示, 在囊胚形成率上, 使用序貫培養(yǎng)液G1/G2, Quinn’s1026/1029進(jìn)行培養(yǎng)的鼠胚的囊胚形成率(70.49％,82.80％)要顯著高于使用簡單培養(yǎng)液EBSS的囊胚形成率(30.56％)。而在胚胎發(fā)育過程中,作者發(fā)現(xiàn)使用簡單培養(yǎng)液EBSS進(jìn)行培養(yǎng)的胚胎在發(fā)育到4-5細(xì)胞階段發(fā)生了較為嚴(yán)重的阻滯,24 h后4-5細(xì)胞的形成率為51.39％(37/72), 而發(fā)育到囊胚階段僅有30.56％(22/72), 而使用序貫培養(yǎng)液的胚胎則未發(fā)生此種現(xiàn)象。這可能是因為序貫培養(yǎng)液應(yīng)對胚胎在卵裂早期和晚期對能量物質(zhì)和氨基酸在需求上的不同做了成分上的調(diào)整, 從而使得胚胎在代謝活動相對較弱的早期和代謝活動相當(dāng)活躍的囊胚階段都得到了合適的物質(zhì)及能量支持, 如在卵裂階段, G1/G2, Quinn’s1026/1029均不含必須氨基酸, 但到了囊胚階段必須氨基酸的含量則遠(yuǎn)高于非必須氨基酸的含量, 而簡單培養(yǎng)液的一個很大的不足是其不含氨基酸等復(fù)合成分, 使得其不能對胚胎發(fā)育階段的改變做出調(diào)整, 致使胚胎發(fā)育停滯在4-5細(xì)胞階段。而在兩種序貫培養(yǎng)液之間的比對上, 作者發(fā)現(xiàn)同樣添加10％人血清白蛋白HSA后, 在囊胚的形成率上使用SAGE系列的Quinn’s1026/1029(82.80％)要高于使用Vitrolife系列的G1/ G2(70.49％), 而美國梅奧醫(yī)學(xué)中心的Morbeck等[5,6]最近在Fertility and Sterility的研究報告顯示添加HSA的SAGE系列序貫培養(yǎng)液的鼠胚囊胚形成率(75％)反而略低于添加HSA的Vitrolife系列序貫培養(yǎng)液的培養(yǎng)結(jié)果(78％)。G1/G2和Quinn’s1026/1029在葡萄糖、有機酸、乳酸、丙酮酸、氨基酸、金屬離子和無機鹽等成分的比例上都存在一定的差異,會對胚胎培養(yǎng)產(chǎn)生不同的影響。與此同時, 不同的小鼠種系,促排卵藥物的種類與劑量以及培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)油、培養(yǎng)用器皿、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)方法和操作過程都有可能對胚胎的發(fā)育結(jié)局產(chǎn)生影響。而培養(yǎng)液在小鼠胚胎體外培養(yǎng)的效果也不完全等同于其他種系胚胎培養(yǎng)的效果。但通過本次實驗, 更加確定了序貫培養(yǎng)液G1/G2和Quinn’s1026/1029在鼠胚體外培養(yǎng)效果上要優(yōu)于早期簡單培養(yǎng)液EBSS, 實驗同樣豐富了對兩種序貫培養(yǎng)液G1/G2和Quinn’s1026/1029的認(rèn)識。

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Influence of different culture solutions on ectogenesis of mouse embryo in newly constructed in vitro fertilization laboratory

RAO Jin-peng, LIU Qing, QIAN Xiao-hong, et al. Reproductive Medicine Center, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou310052, China

ObjectiveTo implement three different culture solutions, as EBSS (SIGMA series), G1 and G2 (Vitrolife series), Quinn’s1026 and Quinn’s1029 (SAGE series), for In vitro culture of Kunming species mouse, in order to evaluate newly constructed IVF laboratory.MethodsFemale mice aged7 weeks were selected to receive human menopausal gonadotropin (HMG)10 IU for ovulation. Human chorionic gonadotropin (HCG)10 IU was injected after48 h for follicle maturity in1:1 cage mate with male mice. After another48 h, normal mouse embryos with2 cells were taken. They were divided into3 groups. Group A received Earle’s balanced saltsolution (EBSS), group B received G1 and G2 solution, and group C received Quinn’s1026 and Quinn’s1029 solution. All solutions contained10％ human serum albumin. Comparison and analysis were made on the results of the three groups.ResultsAfter72 h, the general blastulation rate of mouse embryo was71.54％ (382/534). The blastulation rate of group A was30.56％ (22/72), that of group B was70.49％ (129/183), and that of group C was82.80％ (231/279). Group B and group C had much higher blastulation rate than group A (P＜0.01).ConclusionThe in vitro culture of mouse embryo provides good quality control for the newly constructed IVF laboratory. G1 and G2 in sequential culture Vitrolife and Quinn’s1026 and Quinn’s1029 in SAGE have higher blastulation rate than single EBSS solution.

Culture solution; Mouse embryo; Blastosphere; In vitro culture; Quality control

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.07.197

2015-01-04]

國家自然科學(xué)基金資助課題(項目編號：81370760)

310052 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(饒金鵬 劉青 錢小紅 魏凱 陳劍 金敏)；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院(金帆)