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    兩性霉素B脂質(zhì)體原位凝膠滴眼液的研究

    2015-03-08 03:43:38杜曉俐任偉芳

    杜曉俐,任偉芳,馬 悅,付 洋,宋 娟,楊 麗*

    (沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 沈陽 110016)

    兩性霉素B脂質(zhì)體原位凝膠滴眼液的研究

    杜曉俐,任偉芳,馬 悅,付 洋,宋 娟,楊 麗*

    (沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 沈陽 110016)

    目的制備兩性霉素B脂質(zhì)體(AmB-L)溫敏原位凝膠滴眼液,并對其體外性質(zhì)進(jìn)行研究。方法以泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)為基質(zhì)制備兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠滴眼液,測定其膠凝溫度、離體角膜黏附力和流變學(xué)性質(zhì),以確定最佳處方;并使用無膜溶出法考察凝膠的溶蝕及藥物釋放行為。結(jié)果最佳的凝膠基質(zhì)組成為w(P407)∶w(P188)= 21∶2,其淚液稀釋前后的膠凝溫度分別為(25.6±0.2)℃和(34.3±0.3)℃,室溫時黏度較低,35 ℃時黏度急劇變大,黏附力適宜。體外釋放試驗表明凝膠溶蝕與藥物釋放呈線性相關(guān)。結(jié)論制備的兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠滴眼液符合眼部用藥應(yīng)用要求,體外溶蝕與釋放符合零級動力學(xué)特征。

    藥劑學(xué);兩性霉素B脂質(zhì)體;溫敏原位凝膠;膠凝溫度;流變學(xué);生物黏附力;體外釋放

    真菌性角膜炎是世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重致盲性眼病,近年來發(fā)病率逐年上升[1-3]。兩性霉素B作為一種治療真菌性角膜炎的藥物已有多年的臨床應(yīng)用歷史,研究表明,局部應(yīng)用時治愈率可高達(dá)87.5%,目前是治療念珠菌性角膜炎的首選藥物。然而目前沒有商品化的眼用制劑供臨床應(yīng)用,只能用注射劑現(xiàn)配現(xiàn)用,但兩性霉素B注射劑是一種用去氧膽酸鈉增溶的膠束溶液,滴眼后刺激性較大,導(dǎo)致患者順應(yīng)性差,且局部吸收少、生物利用度低,需反復(fù)頻繁的給藥,增加了藥物的毒性及不良反應(yīng)[4-5]。

    脂質(zhì)體作為眼部給藥系統(tǒng)具有毒性低、刺激性小、生物相容性好等優(yōu)點。有研究報道,兩性霉素B脂質(zhì)體滴眼液能夠顯著降低藥物的局部刺激性、毒性及不良反應(yīng),延長藥物在眼內(nèi)的半衰期[6-10]。但脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差,黏度較低,藥物在作用位點滯留時間較短,致使藥物的療效降低。溫敏原位凝膠在室溫時為溶液,滴入眼后迅速發(fā)生相轉(zhuǎn)變成為半固體凝膠,能延長藥物的角膜前滯留時間,從而提高藥物的生物利用度[11]。將脂質(zhì)體分散其中,高濃度凝膠態(tài)對脂質(zhì)體具有穩(wěn)定作用,并延緩藥物的釋放,達(dá)到長效的目的。但目前,還未見關(guān)于兩性霉素B脂質(zhì)體原位凝膠型滴眼液的研究報道。作者首次將兩性霉素B脂質(zhì)體制成原位凝膠型滴眼液,對其處方組成進(jìn)行優(yōu)化,并考察體外藥物釋放行為,為兩性霉素B滴眼液的研究與開發(fā)提供實驗依據(jù)。

    1 儀器與材料

    JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠新涇分廠),UV-2000 紫外-可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司),恒溫水浴鍋(上海衡平儀器儀表廠),恒溫振蕩器(天津歐諾儀器儀表廠),黏附力測定裝置(自制),AR 2000ex流變儀(T.A. Instruments, Ltd., USA )。

    兩性霉素B脂質(zhì)體(自制),泊洛沙姆407(P407,德國巴斯夫公司),泊洛沙姆188(P188,德國巴斯夫公司),模擬淚液(自制)。

    2 方法

    2.1 兩性霉素B脂質(zhì)體原位凝膠的制備

    將處方量的泊洛沙姆407和泊洛沙姆188于高速攪拌下緩緩加入兩性霉素B脂質(zhì)體溶液中,繼續(xù)攪拌使分散均勻,然后在4 ℃下攪拌,使之溶解,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 處方篩選

    按表1處方組成,制備兩性霉素B脂質(zhì)體原位凝膠滴眼液,按“2.3”條方法測定膠凝溫度,以膠凝溫度為評價指標(biāo)篩選適宜處方。

    2.3 膠凝溫度的測定

    2.3.1 兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠的膠凝溫度

    取兩性霉素B脂質(zhì)體泊洛沙姆溶液1 mL加至西林瓶中,然后將其置于4 ℃恒溫水浴中,實驗開始時水浴溫度以3 ℃的漲幅逐漸升高,在相變溫度區(qū)(25~35)℃以1 ℃的漲幅逐漸升高,每個溫度下制劑需平衡10 min,在接近膠凝時以0.1 ℃的漲幅升高,每個溫度下制劑需平衡2 min。平衡后將西林瓶傾斜90°,觀察內(nèi)容物流動情況。西林瓶內(nèi)液體不流動時的溫度為膠凝溫度。測定3次取平均值[12]。

    2.3.2 兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠經(jīng)模擬淚液稀釋后的膠凝溫度

    滴眼液在滴入眼后,淚液會對其有一定的稀釋作用。通常認(rèn)為滴入的藥液與淚液的體積比大約為40∶7[13],所以將AmB-L泊洛沙姆溶液與模擬淚液(每升模擬淚液中含碳酸氫鈉2.189 g、氯化鈉6.789 g、二水氯化鈣84.9 mg和氯化鉀1.389 g)按體積比40∶7進(jìn)行稀釋,按“2.3.1”條方法測定膠凝溫度。

    2.4 兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠流變性質(zhì)的考察

    使用TA Instruments AR 2000ex流變儀對凝膠的流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察,選擇直徑為40 mm的測頭,流動模式下分別設(shè)定流變儀溫度為20 ℃和35 ℃,剪切速率范圍0~120 s-1,繪制原位凝膠的黏度-剪切速率曲線。

    2.5 兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠生物黏附力的測定

    黏附力測定裝置如圖1所示[14]。取新鮮兔角膜,用生理鹽水沖洗干凈后吸干表面水分,將上皮朝外固定于小柱(r = 0.5 cm)下端,調(diào)節(jié)裝置平衡。將裝置放入35 ℃恒溫箱中,滴加AmB-L泊洛沙姆溶液40 μL于可調(diào)節(jié)高度的平臺上,將平臺高度調(diào)至角膜可恰好接觸溶液后,靜候5 min待溶液完全膠凝。將5.0 g砝碼放于裝置左側(cè)破壞其平衡使角膜與凝膠接觸,10 min后,除去砝碼,打開輸液器開關(guān),以5 mL·min-1勻速滴水至已預(yù)先稱好質(zhì)量的小瓶中,直至角膜與凝膠恰好分離。計算單位面積黏附力。計算黏附力的公式為f= 0.98 m/πr2。其中:m為水的質(zhì)量,r為半徑。

    Fig. 1 Bioadhesive force-measuring device圖1 黏附力測定裝置

    2.6 兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠的溶蝕行為與釋放行為的考察

    2.6.1 凝膠溶蝕行為考察

    使用無膜溶出法研究AmB-L溫度敏感原位凝膠的溶蝕行為。取AmB-L泊洛沙姆溶液1 mL置于已預(yù)先稱好質(zhì)量的5 mL西林瓶中,記錄質(zhì)量。然后將其放入35 ℃的恒溫振蕩器中平衡10 min,使制劑完全膠凝,在凝膠表面小心加入模擬淚液1 mL作為釋放介質(zhì)。100 r·min-1恒溫振蕩預(yù)先設(shè)置的時間后,倒出全部釋放介質(zhì),擦干西林瓶表面,稱質(zhì)量,然后重新放回恒溫振蕩器重復(fù)以上操作,直至凝膠剩余質(zhì)量不足20%為止[15]。以凝膠累積溶蝕量對時間作圖,得凝膠溶蝕曲線。

    2.6.2 凝膠中藥物的釋放

    取溶蝕實驗得到的釋放介質(zhì)樣品適量,將脂質(zhì)體稀釋破壞后,用紫外分光光度法測定藥物濃度。以累積藥物釋放量對時間作圖,得藥物釋放曲線。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 膠凝溫度的測定結(jié)果

    眼用原位凝膠應(yīng)在室溫下為流動的液體,滴入眼后應(yīng)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槟z,所以研究膠凝溫度是處方研究的重要部分。P407是一種無毒、無刺激的藥用輔料,常作為溫敏原位凝膠的基質(zhì),但是其成膠溫度較低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的P407膠凝溫度即為約25 ℃),存在實際使用時需冷藏的弊端,且經(jīng)前期研究表明脂質(zhì)體的加入會使膠凝溫度進(jìn)一步降低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的P407溶液加入脂質(zhì)體后膠凝溫度從25 ℃降低至19.8 ℃),所以本實驗將其與P188合用,提高膠凝溫度,以期獲得具有適宜膠凝溫度(25~35 ℃)的凝膠基質(zhì)。

    不同處方凝膠基質(zhì)的膠凝溫度測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明,隨P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,凝膠的膠凝溫度降低;而隨P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,膠凝溫度升高。經(jīng)模擬淚液稀釋后,凝膠的膠凝溫度均有一定升高。模擬淚液稀釋前與稀釋后膠凝溫度均符合眼用要求的處方為F2、F9、F15。

    泊洛沙姆是由親水性聚氧乙烯 (PEO)和疏水性聚氧丙烯(PPO)組成的三嵌段共聚物,當(dāng)達(dá)到臨界膠束濃度和臨界膠束溫度時,泊洛沙姆形成PEO鏈段為外殼、疏水性PPO鏈段為內(nèi)核的膠束,溫度繼續(xù)升至膠凝溫度時,膠束聚集相互纏結(jié)形成凝膠。P407中PEO和PPO的分子數(shù)量比為70∶30,P188中PEO和PPO的分子數(shù)量比為80∶20,臨界膠束溫度與PPO的分子數(shù)量呈反向相關(guān),加入P188后PPO比例降低,所以膠凝溫度升高。淚液稀釋后,因單位面積內(nèi)膠束的量減少,所以需要更高的溫度促使膠束網(wǎng)絡(luò)的堆砌和纏結(jié)以形成凝膠。

    Table 1 Gelation temprature of various Poloxamer formulations beforeand after tear dilution (±s, n=3)表1 不用處方的膠凝溫度

    Table 1 Gelation temprature of various Poloxamer formulations beforeand after tear dilution (±s, n=3)表1 不用處方的膠凝溫度

    Formula w(P407 )/% w(P188 )/% θ(GT before dilution)/℃ θ(GT after dilution)/℃F1 18 1 26.5±0.2 >35 F2 19 1 25.8±0.3 34.6±0.3 F3 20 1 24.2±0.2 33.2±0.1 F4 21 1 22.4±0.1 31.7±0.2 F5 22 1 20.5±0.3 30.1±0.1 F6 18 2 >35 >35 F7 19 2 30.2±0.2 >35 F8 20 2 27.4±0.1 >35 F9 21 2 25.6±0.2 34.3±0.3 F10 22 2 21.6±0.3 30.6±0.2 F11 18 3 >35 >35 F12 19 3 34.3±0.4 >35 F13 20 3 31.0±0.2 >35 F14 21 3 28.8±0.1 >35 F15 22 3 26.0±0.2 34.7±0.2

    3.2 流變性質(zhì)的考察

    根據(jù)膠凝溫度的測定結(jié)果,對處方F2、F9、F15進(jìn)行了流變性質(zhì)的測定,結(jié)果如圖2。由圖2可知,20 ℃時各處方黏度不隨剪切速率的變化而變化,是典型的牛頓流體。35 ℃時各處方黏度增大并出現(xiàn)隨剪切速率的增大黏度急劇降低的現(xiàn)象,表現(xiàn)出了非牛頓流體的特征。在20 ℃和35 ℃下,均表現(xiàn)為濃度越大的各處方黏度越大。

    對于泊洛沙姆膠型原位凝膠,在膠凝溫度以下膠束和單體占主導(dǎo),內(nèi)摩擦力較小,黏度較低;當(dāng)溫度達(dá)到膠凝溫度以上時,膠束之間相互聚集增強,凝膠形成,內(nèi)摩擦力大。因此,黏度急劇增大,但隨剪切速率的增大,膠束的聚集被破壞,所以黏度又急劇降低。

    正常生理條件下,眼瞼和眼球運動產(chǎn)生的剪切速率范圍是很寬的,眨眼間隙產(chǎn)生的剪切速率為3×10-2~0.1 s-1;而眨眼時的剪切速率可達(dá)到4 500~4×104s-1[16],因此在生理條件下凝膠經(jīng)剪切變稀的這一性質(zhì)不會阻礙眨眼等正常生理運動,沒有不適感,能使藥物在眼球表面分布更加均勻,增加患者的順應(yīng)性。

    Fig. 2 Viscosity curves of different formulations at 20 ℃ and 35 ℃圖2 不同處方在20℃和35℃時的黏度曲線

    3.3 離體角膜黏附力的測定結(jié)果

    黏附力對于藥物在眼前的滯留時間非常重要,黏附力越大,藥物的滯留時間越長,存留在眼前的藥物濃度越高;但如果黏附力過大,容易對角膜造成損害。本文的黏附力測定結(jié)果見圖3。綜合膠凝溫度和黏度測定的結(jié)果,F(xiàn)9既符合膠凝溫度的要求,又有適宜的黏度和較大的黏附力,確定其為最優(yōu)處方。

    聚合物通過與結(jié)膜和角膜表面的黏蛋白相互作用而產(chǎn)生黏附力。黏蛋白具有1個蛋白或多肽的核,核上的糖基側(cè)鏈?zhǔn)桥c聚合物作用的主要位點,一般認(rèn)為具有羧基、羥基等親水性官能團的聚合物更易與黏蛋白產(chǎn)生靜電作用和氫鍵吸附以及疏水作用。所以聚合物濃度越大,與黏蛋白產(chǎn)生的相互作用便越強,黏附力也越大。

    Fig. 3 Bioadhesive force of F2, F9, F15圖3 黏附力的測定結(jié)果

    3.4 凝膠溶蝕與藥物釋放的測定結(jié)果

    處方F9的凝膠溶蝕曲線與藥物釋放曲線見圖4~6。由圖4~6可見,凝膠的溶蝕和藥物釋放均以恒定的速率進(jìn)行,直至剩余凝膠少于初始凝膠的20%。將凝膠溶蝕量和兩性霉素B累積釋放量分別對時間回歸,均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,其回歸方程分別為 y=30.664χ-6.542 9,r=0.999 3;y=22.238χ-1.716 7,r=0.999 4),符合零級動力學(xué)的特征。以藥物累積釋放量對凝膠溶蝕量作圖,亦呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,即y=0.750 6χ+1.216 2,r=0.999 4,證明了藥物的釋放依靠凝膠的溶蝕。

    Fig. 4 Curve of gel erosion versus time圖4 凝膠溶蝕-時間曲線

    Fig. 5 Curve of cumulative drug release versus time圖5 藥物累積釋放量-時間曲線

    泊洛沙姆溫敏原位凝膠有很好的水溶性,模擬淚液中的水分子從凝膠表面進(jìn)入凝膠使其溶解,凝膠溶蝕從而藥物得到釋放,凝膠的溶蝕速率是藥物釋放的主要影響因素。通過溶蝕控制藥物釋放速率,能避免藥物的突釋,提高用藥安全性。脂質(zhì)體粒徑較大,很難從凝膠中擴散出來,因此主要通過凝膠的溶蝕實現(xiàn)藥物的釋放。

    眼部給藥系統(tǒng)體外釋藥方法可分為有膜釋藥和無膜釋藥兩種。有膜釋藥又分為透析袋法、改良《美國藥典》溶出度測定第三法、立式擴散池法;無膜釋藥不使用半透膜,在振蕩條件下模擬淚液對制劑能產(chǎn)生類似眨眼時的剪切作用,更能模擬淚液分泌溶蝕的情況。而眼用溫敏凝膠劑易溶于水,通過淚液對其表面的溶蝕而消除,藥物才得以釋放,所以作者采用無膜溶出法,更符合眼用凝膠在體內(nèi)的真實情況。

    Fig. 6 Curve of cumulative drug release versus gel erosion圖6 藥物累積釋放量-凝膠溶蝕曲線

    4 結(jié)論

    本研究通過膠凝溫度的測定、流變學(xué)研究及離體角膜黏附力的測定篩選兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏原位凝膠的最佳處方,并對其體外釋放行為進(jìn)行研究。結(jié)果表明,P407與P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為21∶2時膠凝溫度為(25.6±0.2) ℃,淚液稀釋后的膠凝溫度為(34.3±0.3) ℃;室溫時黏度較低為牛頓流體,膠凝后為非牛頓流體;黏附力較大,可將其作為最優(yōu)處方。其體外釋放結(jié)果表明,藥物釋放與凝膠溶蝕呈線性相關(guān),且都表現(xiàn)為零級動力學(xué)。

    作者制備的兩性霉素B脂質(zhì)體溫敏凝膠滴眼液符合眼部用藥的應(yīng)用要求,延長藥物在眼內(nèi)的滯留時間,從而提高療效,降低了毒性及不良反應(yīng),提高患者使用順應(yīng)性,具有非常好的應(yīng)用價值。

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    Study on oph thalmic amphotericin B lipos omal in situ thermosensitive gel

    DU Xiao-li, REN Wei-fang, MA Yue, FU Yang, SONG Juan, YANG Li
    (School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

    ObjectiveTo prepare ophthalmic Amphotericin B liposomal (AmB-L) in situ thermosensitive gel and study its in vitro properties.MethodsAmB-L in situ gel with poloxamer 407 (P407) and poloxamer 188 (P188) was prepared and the gelation temperature, rheological behavior and bioadhesive force were determined to choose the best formulation. The drug release rate of the in situ gels was determined using a membraneless model.ResultsThe best composition of gel base is w(P407)∶w(P188)=21∶2 with gelation temperature before and after tear dilution of (25.6 ± 0.2) ℃ and (34.3±0.3) ℃, separately. The viscosity of this gel base was low under ambient temperature but rises rapidly at temperatureof 35 ℃. It also has appropriate bioadhesive force. Drug release was linearly correlevant with gel erosion.ConclusionThe ophthalmic AmB-L in situ thermosensitive gel meets the requirements of ophthalmic application and the in vitro release behavior follows zero-order kinetics.

    pharmaceutics; Amphotericin B liposome; In situ thermosensitive gel; gelation temperature; rheology; bioadhesive force; In vitro release

    R94

    A

    (本篇責(zé)任編輯:趙桂芝)

    (2015)05-0181-08

    10.14146/j.cnki.cjp.2015.05.004

    2015-03-30

    杜曉俐(1987-), 女(漢族), 河北滄州人, 碩士研究生, E-mail 287044620@qq.com; *

    : 楊麗(1966-), 女(漢族), 吉林集安人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物新型給藥系統(tǒng)的研究, Tel. 024-23986349, E-mail pharm305@126.com。

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