呋喃二烯納米脂質(zhì)載體的制備及其性質(zhì)的考察

孫林林，姜偉化，陳 寧，張建梅，王東凱

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

呋喃二烯納米脂質(zhì)載體的制備及其性質(zhì)的考察

孫林林，姜偉化，陳 寧，張建梅，王東凱*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的制備呋喃二烯納米脂質(zhì)載體，對其處方工藝進行優(yōu)化，并考察其制劑的性質(zhì)。方法以乳化超聲法制備呋喃二烯納米脂質(zhì)載體，根據(jù)單因素考察的結(jié)果，通過正交設(shè)計實驗，優(yōu)選出最佳制備工藝處方。對粒子的形態(tài)、粒徑和電位進行表征，微柱離心法測定包封率。結(jié)果最優(yōu)處方中MCT占總脂質(zhì)質(zhì)量的30%，乳化劑用量為20 g·L-1。F68與磷脂的質(zhì)量比為2∶1。該優(yōu)化處方制備的納米粒子呈類球型，粒徑為94.64 nm，zeta電位為-19.4 mV，包封率為91.27%。結(jié)論本實驗制備的呋喃二烯納米脂質(zhì)載體粒徑小，穩(wěn)定性較好且藥物包封率高。

藥劑學(xué)；納米脂質(zhì)載體；乳化-超聲分散法；正交設(shè)計；呋喃二烯；包封率

呋喃二烯(furanodiene，F(xiàn)N)是從姜科姜黃屬植物莪術(shù)中提取分離得到的倍半萜類化合物，結(jié)構(gòu)中的十元二烯環(huán)在高溫條件下會由椅式過渡態(tài)發(fā)生[3,3]-σ遷移的Cope重排反應(yīng)，產(chǎn)物為莪術(shù)烯。所以該結(jié)構(gòu)有遇光和溫度高于100 ℃時不穩(wěn)定等理化性質(zhì)[1]。 藥理研究表明[2]，呋喃二烯抑制腫瘤活性顯著，具有廣譜、低毒、高選擇性的抗癌作用，但其在水中極難溶解且穩(wěn)定性差。

脂質(zhì)納米粒包括固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)和納米脂質(zhì)載體( nanostructured lipid carriers，NLC)，由天然材料組成，在體內(nèi)具有固定的降解途徑，生物相容性好，毒性低，理化性質(zhì)穩(wěn)定等特點。另外，他們具有被動靶向性，可將使藥物蓄積于腫瘤組織，提高抑瘤效果[3]。已有文獻報道PEG化呋喃二烯固體脂質(zhì)納米粒的制備[4]，但是SLN依然存在不足之處，包括載藥量低、藥物析出等現(xiàn)象。NLC 采用混合脂質(zhì)為載體，將常溫下為液態(tài)的脂質(zhì)加入到固態(tài)脂質(zhì)中，不僅兼有SLN的優(yōu)點，而且可以增加對藥物分子的包載，避免放置過程中藥物外排，提高了藥物的穩(wěn)定性[5-7]，很好的解決SLN的不足。作者本研究通過乳化-超聲分散法制備呋喃二烯納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并對其處方工藝進行了優(yōu)化。

1 儀器與材料

BS110S精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），PF-101T集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），XW-80A渦旋混合器（上海精科實驗有限公司），KQ-400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所），PB-10 Sartorius普及型pH計（德國賽多利斯股份公司），Zetasizer Nano ZS 90粒度測定儀（英國馬爾文公司），透射電子顯微鏡（TEM，JEM-1200 EX，日本JEOL公司），80-2離心機（上海君竺儀器制造有限公司），LC-10A 高效液相色譜儀、DSC-60差示掃描量熱儀（日本島津公司）。

呋喃二烯（FN，海南碧凱藥業(yè)有限公司），注射用大豆磷脂（PC，上海太偉藥業(yè)有限公司），單硬脂酸甘油酯（GMS，天津博迪化工股份有限公司），中鏈甘油三酸酯（MCT，鐵嶺北亞藥用油有限公司），泊洛沙姆188（F68，德國BASF公司），脫氧膽酸鈉（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠），吐溫-80（天津康科德科技有限公司），SephadexG-50葡聚糖凝膠（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司），甲醇（色譜純，天津康科德科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方前研究

2.1.1 HPLC法測定呋喃二烯的含量

經(jīng)紫外掃描，確定檢測波長為216 nm。經(jīng)篩選優(yōu)化，確定流動相的組成為甲醇-水（體積比為95∶5），進樣體積為20 μL，流速為1.0 mL·min-1。在該條件下，呋喃二烯的保留時間為8.0 min左右，溶劑、輔料對藥物的測定無干擾。方法學(xué)驗證得知呋喃二烯質(zhì)量濃度在0.5～80 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A= 57 004 ρ-5 684.6 (r=0.999 8)）；低（10 mg·L-1）、中（20 mg·L-1）、高（30 mg·L-1）3個質(zhì)量濃度的平均回收率為100.3%，RSD分別為0.93%、0.82%和0.76%；低、中、高3個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為0.82%、0.60%和0.46%，日間精密度RSD分別為1.71%、1.98%和1.29%；于4 ℃冰箱中溶液24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好（RSD=0.62%），上述結(jié)果表明建立的HPLC法適合呋喃二烯含量的測定。

2.1.2 FN在水和油中的溶解度測定

精密稱取數(shù)份過量的呋喃二烯原料藥，置于具塞玻璃試管中，分別加入相同量的不同溶液(表1)，渦旋15 min后，將具塞玻璃試管置于水浴振蕩器中37 ℃振搖72 h，平衡后在規(guī)定時間取樣，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，測定藥物溶解度，結(jié)果見表1、2。

Table 1 Equilibrium solubility of FN in different solutions at 37 ℃ (n=3)表1 呋喃二烯在不同水溶液中的平衡溶解度(n=3)

結(jié)果表明，F(xiàn)N在水中溶解度很小，幾乎不溶于水，不同pH值的磷酸鹽緩沖液并未對其溶解度有明顯的影響，加入一定量的Tween-80、SDS之后能明顯增加FN在水中的溶解度。

Table 2 Equilibrium solubility of FN in different oil solutions at 37 ℃(n=3)表2 呋喃二烯在不同油溶液中的平衡溶解度(n=3)

結(jié)果表明，F(xiàn)N在MCT和LCT中有一定的溶解度，且在兩者中的溶解度無顯著性差異（P > 0.05）。

2.1.3 FN的表觀油水分配系數(shù)的測定

取6支10 mL具塞試管，分為2組，每組3支，分別精密量取質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1與0.1 g·L-1水飽和的正辛醇FN溶液1.0 mL，加正辛醇飽和的水溶液至刻度，密封塞子，置于水浴振蕩器中，37 ℃、100 r·min-1振蕩72 h，使達到分配平衡。分離水相和油相。經(jīng)甲醇稀釋后，用HPLC法測定水相及油相的藥物質(zhì)量濃度。計算lgP值的結(jié)果見表3。

Table 3 Determination of oil-water partition coefficient of furanodiene (n=3)表3 呋喃二烯油水分配系數(shù)的測定(n=3)

結(jié)果表明，由高、低2個質(zhì)量濃度測得的FN油/水分配系數(shù)的對數(shù)值相近，lgP值均在5.0左右，該數(shù)值表明藥物為強脂溶性藥物。

2.2 FN-NLC的制備

2.2.1 脂質(zhì)材料的選擇

常見的固體脂質(zhì)有單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、棕櫚酸和山崳酸甘油酯。由于 FN的化學(xué)結(jié)構(gòu)在溫度高于100 ℃時可發(fā)生Cope重排反應(yīng)而不穩(wěn)定，所以宜選擇熔點較低的固體脂質(zhì)。山崳酸甘油酯作為脂質(zhì)材料時，制備溫度需要達到85 ℃，不利于FN的穩(wěn)定。棕櫚酸為固體脂質(zhì)時，放冷后呈黏稠狀混濁液。單硬脂酸作為脂質(zhì)材料時，制備的納米粒易產(chǎn)生絮凝，穩(wěn)定性不好。因此選擇單硬脂酸甘油酯作為固態(tài)脂質(zhì)。

大豆油和中鏈油是常見的液態(tài)脂質(zhì)。FN在兩者中的溶解度差別不大，但是MCT黏度小、流動性好、易被多種乳化劑乳化、注射給藥安全性高，因此作者選擇中鏈油作為液態(tài)脂質(zhì)。

2.2.2 乳化劑種類的選擇

文獻報道[8-9]，使用復(fù)合乳化劑可以有效的降低粒徑，提高穩(wěn)定性。本研究以粒徑和放置穩(wěn)定性為指標，考察豆磷脂分別與吐溫-80、Solutol HS 15、F68及聚氧乙烯蓖麻油（Cremphor EL 35）4種非離子型表面活性劑聯(lián)合使用對制劑的影響，結(jié)果見表4。

Table 4 The effect of various emulsifiers combination on particle size and stability表4 不同乳化劑聯(lián)用對粒徑和穩(wěn)定性的影響

結(jié)果表明，選用豆磷脂和F68作為復(fù)合乳化劑時，制備的制劑的粒徑小且穩(wěn)定性較好。

采用乳化-超聲分散法制備FN-NLC，方法如下：稱取處方量的FN、GMS、MCT置于小燒杯中，加熱至70 ℃熔融、混勻，恒溫水浴鍋中保持恒溫，構(gòu)成有機相。精密稱取處方量F68、大豆磷脂和脫氧膽酸鈉，溶于適量的蒸餾水中，使其恒溫保持在70 ℃，構(gòu)成水相。用預(yù)熱至70 ℃的注射器，緩慢地將水相注入在一定轉(zhuǎn)速攪拌下的恒溫油相中，繼續(xù)攪拌8 min，形成半透明O/W型初乳，70 ℃保溫條件下，以超聲波細胞粉碎機超聲處理4 min制備納米乳。之后迅速冰浴固化數(shù)分鐘，即冷卻形成均一、半透明、呈淡藍色乳光的納米粒分散液。將納米粒分散液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，4 ℃密封保存。

2.3 包封率的測定方法

采用葡聚糖凝膠微柱離心法測定包封率[10]。將用去離子水平衡好的SephadexG-50葡聚糖凝膠裝入2.5 mL注射器的針筒中，2 000 r·min-1離心3 min，制成Sephadex G-50的微型柱。取制備好的FN納米脂質(zhì)載體0.1 mL 2份，其中1份直接置于10 mL量瓶中，加入去離子水1.5 mL，以甲醇破乳并稀釋定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即為過柱前溶液。另1份加于制備好的葡聚糖凝膠微柱頂端，洗脫液為去離子水，按上述條件離心，每次洗脫液為0.5 mL，洗脫3次，合并洗脫液于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即為過柱后溶液。按“2.1.1”條色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積。包封率（wEE）= 納米粒中的藥物質(zhì)量/處方中藥物的總質(zhì)量×100 %。

2.4 FN-NLC處方工藝的優(yōu)化考察

經(jīng)過單因素初步考察，確定影響FN-NLC包封率的主要因素為脂質(zhì)質(zhì)量比（GMS/MCT）、復(fù)合乳化劑的比例和乳化劑的用量。采用正交試驗設(shè)計L9(34)對處方做進一步的篩選。各因素及水平見表5。

Table 5 The factor and levels table of orthogonal design表5 正交實驗因素和水平

以包封率為主要評價指標，正交試驗結(jié)果見表6。

Table 6 The orthogonal experimental results of wEE表6 正交設(shè)計包封率的結(jié)果

Table 7 Composite score and variance analysis表7 綜合評分方差分析

通過直觀分析，可知各因素對包封率的影響大小依次為A2＞A1＞A3，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，通過極差R值的比較，各因素對實驗結(jié)果影響的大小順序為：A＞B＞C，由此可以得出包封率的最優(yōu)條件為A2B2C2。

由方差分析可知，因素A、B對包封率影響顯著。由表3、4可知最佳制備工藝為A2B2C2，即MCT占總脂質(zhì)質(zhì)量的30%，乳化劑用量為的20 g·L-1，F(xiàn)68與磷脂質(zhì)量比為2。按照優(yōu)化處方制備呋喃二烯納米脂質(zhì)載體，測得其粒徑為94.64 nm，電位為-19.4 mV，包封率為91.27%，載藥量為4.93%。

2.5 NLC的形態(tài)、粒徑及zeta電位

NLC納米混懸液加蒸餾水稀釋，取適量滴至銅篩網(wǎng)上，20 g·L-1磷鎢酸負染，室溫放置至形成薄膜后用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)（圖1）。由圖1可見，納米粒呈類球形。

Fig. 1 TEM photograph of FN-NLC圖1 呋喃二烯納米脂質(zhì)載體的透射電鏡照片

取稀釋后NLC納米混懸液適量，搖勻[11-12]，用Malvern激光散射粒度分析儀測定粒徑分布及zeta電位（圖2、3）。由圖 2、3可見，粒徑為94.64 nm，zeta電位為-19.4 mV，表明制得的FN-NLC表面帶負電荷。

Fig. 2 Particle size of typical FN-NLC圖2 呋喃二烯納米脂質(zhì)載體的粒徑分布

Fig. 3 Zeta potential of typical FN-NLC圖3 呋喃二烯納米脂質(zhì)載體的電位分布

2.6 DSC曲線的測定

分別取適量的FN、FN-NLC凍干粉和空白NLC凍干粉末，置密閉的鋁坩鍋中，測定DSC曲線（圖4）。由圖4可知，F(xiàn)N在66.78 ℃有明顯的吸收峰；而FN-NLC的DSC曲線只顯示在48.78 ℃時有1個很小的吸收峰，未見藥物峰，考慮到納米粒表面不存在藥物晶體，提示結(jié)構(gòu)中藥物應(yīng)該是以無定型狀態(tài)分散于納米粒中。

Fig. 4 DSC thermograms of blank-NLC(a), FN-NLC(b) and FN(c)圖4 空白NLC凍干粉末(a)、FN-NLC凍干粉(b)和FN(c)的差示掃描量熱法分析結(jié)果

3 討論

a. 乳化劑的正確選擇是能否制備出穩(wěn)定的NLC的關(guān)鍵因素。磷脂是制備乳劑時最常用的乳化劑，它主要以囊泡雙層膜的形式存在水相中。在NLC的制備中，加入磷脂作為助乳化劑，與非離子型表面活性劑組成復(fù)合乳化劑，不僅可以有效的降低粒徑，同時保證油水兩相的界面的穩(wěn)定。實驗中考察了4種乳化劑（Tween-80、Solutol HS 15、Poloxamer 188和Cremphor EL 35）與磷脂聯(lián)用的效果，其中Poloxamer 188與磷脂制備的NLC粒徑適宜且穩(wěn)定性好于其他3種。這可能是其他3種更易形成膠束，增大了藥物在水中的溶解度，從而使粒子相互碰撞機會增加，最后粒子聚合甚至膠凝。

b. 測定包封率的方法很多，作者曾考慮選用超速離心法測包封率，然而在20 000 r·min-1離心2.5 h并未能將納米粒中油水相分離，表明此法并不適用該制劑。而透析法測得的包封率低，重現(xiàn)性不好，最終選用葡聚糖凝膠微柱離心法進行包封率的測定，此方法耗時短、脂質(zhì)載體溶液稀釋倍數(shù)小，且不需要昂貴的儀器設(shè)備。

c. 透射電鏡測得的粒徑較Malvern測得值偏小。這是因為Malvern測得的粒徑是納米粒的水合半徑，粒子外面有一層很厚的水化層；透射電鏡測得的是干燥的樣品，沒有水化層，所以粒徑較小[13]。電位是表征納米混懸微粒的一個重要指標，可以用于預(yù)測膠體粒子的物理穩(wěn)定性。電位絕對值比較高的制劑由于電子排斥作用，很少出現(xiàn)粒子的聚集，所以通常有較好的穩(wěn)定性。脫氧膽酸鈉的加入可以提高zeta電位絕對值，從而使粒子更加穩(wěn)定。

參考文獻：

[1] 孫秀燕, 鄭艷萍, 劉志峰. 溫莪術(shù)環(huán)狀含氧倍半萜類化學(xué)成分的研究[J]. 分析測試學(xué)報, 2006, 25(6): 27-30.

[2] 鄭艷萍, 孫秀燕, 巴真真. 呋喃二烯的體內(nèi)外抗腫瘤作用研究[J]. 煙臺大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)與工程版, 2008, 21(2): 115-119.

[3] 盧琳, 熊素彬. EPR效應(yīng)在實體瘤靶向治療中的研究進展[J] . 北方藥學(xué), 2014, 11(7): 73-74.

[4] 謝鑫鑫, 王俊騰, 秦利芳, 等. PEG化呋喃二烯固體脂質(zhì)納米粒的制備及體外巨噬細胞攝取研究[J]. 中國新藥雜志, 2012, 21(21): 2552-2561.

[5] PARDEIKE J, HOMMOSS A, MULLER R H, et al. Lipid nanoparticles (SLN, NLC) in cosmetic and pharmaceutical dermal products [J]. Int J Pharm, 2009, 366: 170-184.

[6] MULLER R H, RADTKE M, WISSING S A. Solid lipid nanoparticles (SLN) and nanostructured lipid carriers (NLC) in cosmetic and dermatological preparations [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(35): 131-155.

[7] ZhANG Xin-xin, GAN Yong, YANG Xing-gang, et al. Preparation of PEG-modified nanostructured lipid carriers loaded with hydroxycampt-othecin and tissue distribution in mice [J]. Acta Pharm Sin, 2008, 43(1): 91-96.

[8] MICHELE T, FRANCO P, TEREZIO I. Stability of drug-carrier emulsions containing phosphatidylcholinemixtures mixtures[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2002, 53(2): 203-208.

[9] MUHLEN A Z, MEHNERT W. Drug release and release mechanism of prednisolone loaded solid lipid nanoparticles[J]. Pharmazie, 1998, 53: 552.

[10] 金鑫, 王絳玉, 張娜, 等. 微柱離心-高效液相色譜法測定莪術(shù)醇脂質(zhì)體的包封率[J]. 中國藥劑學(xué)雜志, 2010, 8(1): 27-32.

[11] 雷欣潮, 劉華鋼, 賴茂祥. 正交實驗法優(yōu)選兩面針的提取工藝研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2011, 22(10): 2494-2495.

[12] 陳辰, 何軍, 陸偉根. 白蛋白作為注射用難溶性藥物載體的研究[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2010, 41(1): 51-54.

[13] QIU Feng, FENG Jun, WU De-qun, et al. Nanosized Micelles Self-Assembled from amphiphilic dextran-graftmethoxypolyethylene glycol/poly(epsilon-caprolactone) copolymers[J]. Eur Polym J, 2009, 45(4): 1024-1031.

Preparation and characteristics of furanodiene nanostructured lipid carriers

SUN Lin-lin, JIANG Wei-hua, CHEN Ning, ZHANG Jian-mei, WANG Dong-kai*
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo prepare furanodiene-loaded nanostructured lipid carriers (FN-NLC), To optimize the formulation and investigate their pharmaceutical properties.MethodsFN-NLC was fabricated by emulsification-ultrasonic method. Based on the single-factor experiments, orthogonal design was used to optimize the formulation. The size and zeta potential were determined by dynamiclight scattering. The morphology of FN-NLC was observed by transmission electron microscopy. Microcolumn centrifugation method was adopted to determine the entrapment efficiency.ResultsThe NLC was prepared with average particle size of 94.64 nm and zeta potential of -19.4 mV. The entrapment efficiency was 91.27%.ConclusionsFN-NLC can improve drug loading capacity with small particle sizes.

pharmaceutics; nanostructured lipid carriers; emulsification-ultrasonic method; orthogonal design; furanodiene; entrapment efficiency

R 94

A

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

（2015）05-0153-09

10.14146/j.cnki.cjp.2015.05.001

2015-03-04

孫林林(1989-), 女(漢族), 山東聊城人, 碩士研究生, E-mail sunlinlinzxjy@126.com;*通訊作者：王東凱(1962-), 男(漢族), 遼寧沈陽人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物新劑型的研究, Tel. 024-23986310，E-mail wangdksy@126.com。