雷公藤甲素對MIA模型大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎c-Jun、MMP-9表達及血清炎性標志物的影響

陳曉昱

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雷公藤甲素對MIA模型大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎c-Jun、MMP-9表達及血清炎性標志物的影響

陳曉昱

目的 觀察雷公藤甲素對膝部骨關(guān)節(jié)炎滑膜c-Jun、MMP-9及血清PGE2、IL-8水平的影響，探討其在膝部骨關(guān)節(jié)炎中的藥理學價值。方法 45只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組及雷公藤甲素組，建立碘乙酸鈉(Monosodium iodoacetate,MIA)膝關(guān)節(jié)炎模型，并給予雷公藤甲素干預，以Western blot及(qRT)-PCR法檢測c-Jun及MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜中蛋白及mRNA水平表達，以酶聯(lián)免疫法檢測外周血中PGE2及IL-8水平。結(jié)果 Western blot及(qRT)-PCR顯示，c-Jun及MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中蛋白及mRNA水平上均有表達，雷公藤甲素組及正常對照組明顯低于模型對照組(P<0.01)，雷公藤甲素組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在血清PGE2及IL-8表達上，雷公藤甲素組及正常對照組明顯低于模型對照組(P<0.05)。結(jié)論 雷公藤甲素可抑制骨關(guān)節(jié)炎滑膜中c-Jun及MMP-9表達，降低外周血PGE2及IL-8水平，抑制炎癥反應，對骨關(guān)節(jié)炎有治療作用。

骨關(guān)節(jié)炎；c-Jun；MMP-9；PGE2；IL-8；雷公藤甲素

0 引言

膝部骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢，其病理改變以滑膜水腫、滲出、增生進而導致關(guān)節(jié)軟骨炎性改變、損毀為特征，其發(fā)生及發(fā)展是多因素、多基因參與的過程[1]。AP-1(Activator protein 1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，由c-Jun、c-Fos等組成，調(diào)節(jié)機體對生長因子、細胞因子、應激及細菌或病毒反應，c-Jun是AP-1復合體內(nèi)的主要活性成分，對基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)分泌有調(diào)控作用[2]。MMPs是蛋白水解酶家族，MMP-9是MMPs中主要成員之一，對骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展及惡化有重要作用，并可誘發(fā)炎性標志物的釋放，如PGE2、IL-8、TNF等[3]。雷公藤甲素是自雷公藤提取的活性成分，具有免疫抑制、抗炎和抗增殖作用，其在類風濕關(guān)節(jié)炎中的作用研究較多，在骨性關(guān)節(jié)炎中的藥理作用還不明確[4]。本研究采用MIA方法建立大鼠膝部骨關(guān)節(jié)炎模型，給予雷公藤甲素干擾，檢測c-Jun及MMP-9在滑膜中的表達，并檢測血清炎性標志物PGE2及IL-8水平，目的在于觀察雷公藤甲素在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用，并探討其機制及臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大鼠45只，由遼寧中醫(yī)藥大學動物試驗室提供并飼養(yǎng)，體重(281.32±19.56)g。碘乙酸鈉(MIA)購自美國Sigma公司，雷公藤甲素(TP)購自福建漢堂生物制藥股份有限公司，PubChem號：24900156，純度高于98%。TmiRNA isolation提取分離試劑盒、RPIM1640、LipofectamineTM2000及TRIzol購自美國Invitrogen公司，All-in-One(tm) tPCR Mix試劑盒購自南京凱基生物公司。c-Jun鼠源多克隆抗體、MMP-9山羊多克隆抗體、PGE2試劑盒、IL-8酶聯(lián)免疫試劑盒均購自北京中杉金橋生物制品有限公司。引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。

1.2 研究方法

1.2.1 動物模型建立、干預及標本采集 45只SD大鼠隨機分為正常對照組(C組)、模型對照組(M組)及雷公藤甲素組(T組)，每組15只。MIA模型大鼠制備方法參照文獻方法[5]。M組及T組將0.3 mg MIA溶液注入大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，右側(cè)膝關(guān)節(jié)注入0.3 mg生理鹽水，C組兩側(cè)膝關(guān)節(jié)均注入0.3 mg生理鹽水，均進行持續(xù)抽屜樣膝關(guān)節(jié)運動。模型建立2周后進行干預。C組及M組給予正常飲食，無干預。T組依據(jù)Meeh-Rubner方法計算劑量，給予3 mg雷公藤甲素每天灌胃1次，連續(xù)14 d。所有大鼠無實驗中脫落，實驗第4周末采用頸椎脫臼法處死所有大鼠，觀察膝關(guān)節(jié)大體標本，C組膝關(guān)節(jié)無腫脹，關(guān)節(jié)軟骨外觀為淡粉白色，光滑、明亮，具有光澤。M組左側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)軟骨失去光澤，表面粗糙，色暗，有黃色滲出。T組左側(cè)膝關(guān)節(jié)略腫脹，關(guān)節(jié)軟骨光澤較暗，表面光滑，無滲出。

1.2.2 Western blot法檢測c-Jun及MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中蛋白水平的表達 按說明書操作步驟提取各膝關(guān)節(jié)滑膜組織中總蛋白，BCA定量試劑盒進行蛋白濃度測定，樣品均定量為6 g/L，每條泳道上樣蛋白量為50 μg，經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓70 V，電泳80 min，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗，ECL發(fā)光后以凝膠顯像儀顯像。

1.2.3 qRT-PCR法檢測c-Jun及MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中mRNA水平的表達 采用RNA分離試劑盒提取并純化各膝關(guān)節(jié)滑膜組織中總RNA；RNA樣本濃度稀釋至1 g/L，按照逆轉(zhuǎn)錄及擴增試劑盒說明書操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增。c-Jun：正義序列5′-GACAUCCGATGCUCUGCCUT-3′，反義序列5′-UGCUGUAGTUCUGCCGCTG-3′；MMP-9：正義序列5′-CAGATGGTCCCGCCATCA-3′，反義序列5′-CCGCGCGTGACGAGUCAC-3′；GAPDH：正義序列5′-GATUCCGUCTGACCUTCAC-3′，反義序列5′-UCCGUGTGCGCACUTGTU-3′。RT反應體系如下：2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，50×Syber Green 2 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。所有反應均設(shè)立復孔，以DEPC水代替模板，cDNA作為陰性對照。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，45個循環(huán)。

1.2.4 血清PGE2、IL-8濃度測定 所有SD大鼠均自球后靜脈叢進行采血，依照酶聯(lián)免疫法試劑盒說明書操作步驟測定血清中PGE2、IL-8濃度。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測結(jié)果 Western blot顯示，在39 kDa處有灰色條帶顯示，為c-Jun在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中蛋白水平表達，M組中表達高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.58，P<0.01)，T組表達低于M組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.42，P<0.05)，C組及T組差異無統(tǒng)計學意義(t=1.43，P>0.05)；在94 kDa處有灰色條帶顯示，為MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中蛋白水平表達，M組中表達高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.23，P<0.01)，T組中表達低于M組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.27，P<0.05)，C組及T組差異無統(tǒng)計學意義(t=1.21,P>0.05)，見圖1、圖2。

圖1 c-Jun、MMP在膝關(guān)節(jié)滑膜組織的蛋白表達

2.2 qRT-PCR檢測結(jié)果 qRT-PCR顯示，c-Jun在膝關(guān)節(jié)滑膜中mRNA水平有表達，M組表達高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.27，P<0.01)，T組表達低于M組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.69，P<0.05)，C組及T組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.93，P>0.05)；MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜中mRNA水平有表達，M組表達高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.96，P<0.01)，T組表達低于M組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.71，P<0.05)，C組及T組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.82,P>0.05)，見圖3。

圖2 c-Jun及MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中蛋白水平表達

圖3 c-Jun及MMP-9在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中mRNA水平表達

2.3 PGE2、IL-8濃度檢測 M組血清PGE2濃度高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.54，P<0.01)；T組PGE2濃度低于M組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.91，P<0.05)；T組PGE2濃度與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.23，P>0.05)。M組血清IL-8濃度高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.38，P<0.01)，T組IL-8濃度低于M組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.78，P<0.05)；T組IL-8濃度與正常對照組對比，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.01，P>0.05)，見表1。

表1 三組血清PGE2、IL-8濃度比較

注：與M組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究采用MIA方法構(gòu)建大鼠膝部骨關(guān)節(jié)炎模型，大體標本顯示，給予雷公藤甲素干預的膝關(guān)節(jié)炎性反應明顯輕于無干預膝關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫及變形較輕，關(guān)節(jié)內(nèi)滲出少，滲出液顏色清淡透明，無干預組滲出液淡黃色渾濁，雷公藤甲素干預組關(guān)節(jié)滑膜光澤及潤滑程度均優(yōu)于無干預組。Western blot及qRT-PCR顯示，在蛋白水平及mRNA水平，膝關(guān)節(jié)炎滑膜組織中c-Jun及MMP-9在模型中的表達量明顯高于正常膝關(guān)節(jié)及雷公藤甲素干預膝關(guān)節(jié)，而雷公藤甲素干預組中二者表達與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義。表明雷公藤甲素可能通過抑制c-Jun表達，從而下調(diào)MMP-9表達，對膝關(guān)節(jié)炎的病理過程在基因水平進行調(diào)控。MMPs在細胞外基質(zhì)中大量存在，可降解細胞外基質(zhì)中的多種蛋白，MMP-9可誘發(fā)細胞外因子釋放，在成纖維細胞增生中起到重要作用，并可導致炎性因子大量釋放[6]。c-Jun形成以AP-1復合體的形式發(fā)揮活性，在轉(zhuǎn)錄水平對多種信號通路具有重要的調(diào)控作用。有研究表明，MMPs活性誘發(fā)及表達上調(diào)均受到AP-1的調(diào)控。雷公藤甲素對單核細胞、中性粒細胞及淋巴細胞等炎性細胞的I-κB、NF-κB、c-Jun均有轉(zhuǎn)錄抑制作用，并可降低炎性反應因子的釋放，進一步減輕對c-Jun上調(diào)誘因的刺激，降低其表達[7]。本研究顯示，M組血清PGE2及IL-8濃度高于C組及T組，說明雷公藤甲素可降低外周血中炎性標志物的分泌。關(guān)節(jié)滑膜水腫、滲出是骨關(guān)節(jié)炎的初發(fā)階段，雷公藤甲素可抑制T細胞中IL-2、IL-8、TNF分泌，MMP-9表達降低后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)及外周血炎性因子釋放也會降低[8]。炎性因子是c-Jun及MMP-9表達上調(diào)的誘發(fā)因素之一，炎性因子釋放減少，誘因隨之減少，c-Jun及MMP-9表達也會降低。由于滑膜增厚是膝骨關(guān)節(jié)炎惡化加重的重要病理階段，是骨關(guān)節(jié)炎進入不可逆轉(zhuǎn)階段的標志，經(jīng)過滑膜增厚階段，關(guān)節(jié)可能會出現(xiàn)損毀及功能喪失[9]。雷公藤甲素對細胞增殖具有明顯的抑制作用，因此，滑膜組織在炎性因子及c-Jun的促增殖作用被抑制，是阻止關(guān)節(jié)損傷進入不可逆階段的重要干預措施[10]。PGE2作為炎性因子，除了加重關(guān)節(jié)損傷外，還會誘發(fā)關(guān)節(jié)疼痛及全身炎癥反應，雷公藤甲素對其分泌的抑制可能同時具有緩解骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疼痛的作用。

本研究顯示，在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中，c-Jun及MMP-9表達水平升高，外周血炎性標志物PGE2及IL-8升高，雷公藤甲素可抑制c-Jun及MMP-9表達，降低外周血PGE2及IL-8水平，抑制炎癥反應，可作為骨性關(guān)節(jié)炎治療藥物進行進一步的藥理學研究。

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Effect of triptolide on c-Jun,MMP-9 expression and serum inflammatory markers in rat MIA osteoarthritis model

CHEN Xiao-yu

(Department of Pharmacy,Shenyang Osteological Hospital，Shenyang 110044,China)

Objective To detect the effect of triptolide on c-Jun and MMP-9 in knee osteoarthritis synovium and serum PGE2and IL-8,discuss the pharmacological value of triptolide.Methods Forty-five SD rats were divided into normal control group,model control group and triptolide group randomly,MIA osteoarthritis models were constructed,and triptolide was given.The c-Jun and MMP-9 expression at protein and mRNA level in knee synovium were detected by Western blot and (qRT)-PCR.Results Western blot and (qRT)-PCR showed that c-Jun and MMP-9 were expressed at protein and mRNA levels in synovium tissues,the expression in triptolide group and normal control group was higher than those of model control group (P<0.01),there was no significant difference between triptolide group and normal control group (P>0.05).Serum PGE2and IL-8 in triptolide group and normal control group were lower than those of model control group (P<0.01),there was no significant difference between triptolide group and normal control group (P>0.05).Conclusion Triptolide can inhibit c-Jun and MMP-9 expression in osteoarthritis synovium,decrease the PGE2and IL-8 levels in peripheral blood,inhibit the inflammatory reaction,it has therapeutic effect on osteoarthritis.

Ostoearthritis；c-Jun；MMP-9；PGE2；IL-8；Triptolide

2015-03-12

沈陽市骨科醫(yī)院藥劑科，沈陽110044

10.14053/j.cnki.ppcr.201511006