刺五加注射液對(duì)大鼠華法林抗凝作用的影響

李婷婷，劉 艷，馮立影，梁曉玲，趙海峰，劉高峰

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刺五加注射液對(duì)大鼠華法林抗凝作用的影響

李婷婷，劉 艷，馮立影，梁曉玲，趙海峰，劉高峰*

目的 研究刺五加注射液對(duì)大鼠華法林抗凝作用的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)影響，為臨床合理用藥提供參考。方法 將Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組(A組)、刺五加注射液給藥組(B組)、華法林對(duì)照組(C組)、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組(D組)，4組大鼠連續(xù)腹腔注射生理鹽水或刺五加注射液(15 mL/kg)14 d。第8天，A、B兩組灌胃給予相同劑量的生理鹽水，C、D兩組灌胃給予華法林溶液(0.2 mg/kg)，并于設(shè)定的一系列時(shí)間點(diǎn)取血。用血凝分析儀測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)，并計(jì)算國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)。用UPLC-MS/MS法聯(lián)合手性色譜柱技術(shù)測(cè)定血漿中華法林(包括S-型和R-型)濃度，用DAS 2.0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 刺五加注射液對(duì)PT、APTT及INR無(wú)明顯影響；與華法林對(duì)照組比較，合用刺五加注射液后，華法林(包括S-型和R-型)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞等顯著升高(P<0.05或P<0.01)，藥效學(xué)參數(shù)PT及INR顯著增加(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 刺五加注射液可減慢華法林(包括S-型和R-型)的代謝，使華法林抗凝作用增強(qiáng)。提示臨床用藥時(shí)應(yīng)盡量避免兩藥聯(lián)合應(yīng)用，以避免出血風(fēng)險(xiǎn)，如必須聯(lián)用，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)。

華法林；刺五加注射液；抗凝作用；藥物相互作用

0 引言

華法林是應(yīng)用最廣泛的口服抗凝藥物，主要用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病，防止血栓的形成與發(fā)展，如防止深靜脈血栓、血栓性靜脈炎，降低肺栓塞的發(fā)病率與病死率，減少外科大手術(shù)、風(fēng)濕性心臟病人工瓣膜置換術(shù)等的靜脈血栓發(fā)生率[1-2]。華法林因其蛋白結(jié)合率高、代謝依賴(lài)細(xì)胞色素P450酶及治療窗窄等特點(diǎn)，易與其他藥物發(fā)生相互作用，導(dǎo)致抗凝不足或出血不良反應(yīng)增加，臨床用藥存在高風(fēng)險(xiǎn)性[3-4]。

刺五加注射液是臨床常用的中藥注射劑，具有平補(bǔ)肝腎、益精壯骨之功效，可用于治療冠心病心絞痛[5]、肝腎不足所致的短暫性腦缺血發(fā)作、腦栓塞、腦動(dòng)脈硬化和腦血栓形成等[6]。由于其在心腦血管領(lǐng)域應(yīng)用較多，與華法林聯(lián)合應(yīng)用時(shí)是否對(duì)華法林的抗凝作用產(chǎn)生影響，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究將從藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)兩個(gè)角度，探討刺五加注射液對(duì)華法林抗凝作用的影響，為兩藥聯(lián)用是否會(huì)產(chǎn)生藥物相互作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)Wistar大鼠，雄性，體重(200±20)g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，合格證號(hào)：SYXK(黑)2006-033。

1.2 藥品與試劑 刺五加注射液(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶，批號(hào)：20121211)；華法林鈉片(上海信誼藥廠有限公司，華法林鈉2.5 mg/片，批號(hào)：18130503)；華法林鈉標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：101163-2001001)；S-華法林標(biāo)準(zhǔn)品、R-華法林標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大TRC股份有限公司，純度98%)；甲氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：101227-201101)；PT試劑(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：105216)；APTT試劑(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：111037)；乙腈、甲醇、乙酸銨為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 Waters UPLC XEVO TQ MS(美國(guó)waters公司)；SK5002雙通道血凝分析儀(深圳市盛信康科技有限公司)；230V-EU微型漩渦混合儀(美國(guó)愛(ài)迪生公司)；MC-19R冷凍離心機(jī)(昊諾斯生物公司)；KQ-500E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HGC-12A型氮吹儀(合肥信諾儀器有限責(zé)任公司)。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 華法林溶液的配制 取1片華法林鈉片(2.5 mg/片)，置于研缽中，加少量吐溫80共研，加入50 mL純化水混勻，所配溶液華法林鈉的濃度為0.05 mg/mL。

1.4.2 動(dòng)物分組與給藥 將Wistar大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組(A組)、刺五加注射液給藥組(B組)、華法林對(duì)照組(C組)、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組(D組)，每組8只，4組大鼠在連續(xù)14 d內(nèi)腹腔注射生理鹽水(A組、C組)或刺五加注射液15 mL/kg(B組、D組)。第8天，A、B兩組大鼠灌胃給予相同劑量的生理鹽水，C、D兩組大鼠均同時(shí)灌胃給予華法林溶液0.2 mg/kg，并于設(shè)定的一系列時(shí)間點(diǎn)斷尾取血。

1.4.3 血漿樣品的采集與處理 藥效學(xué)研究血樣的采集與處理：4組大鼠灌胃給予生理鹽水或華法林溶液后，在0、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h分別取血0.1 mL，置于加枸櫞酸鈉抗凝液的離心管中，3 000 r/min離心15 min，取上清血漿測(cè)定PT及APTT。

藥動(dòng)學(xué)研究血樣的采集與處理：C、D兩組大鼠灌胃給予華法林溶液后，在0.5、1、1.5、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h分別取血0.3 mL置于加肝素抗凝液的離心管中，9 000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確取大鼠血漿100 μL，加入甲氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液(2 μg/mL)50 μL后，加20 μL乙酸渦旋1 min，再加入3 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后，以3 500 r/min離心5 min，取乙酸乙酯層，40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μL 50%乙腈水復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液5 μL注入進(jìn)樣杯中，測(cè)定華法林(S-型和R-型)的血藥濃度。

1.5 凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定 取適量PT試劑置于血凝分析儀試劑預(yù)溫位中，37 ℃下預(yù)熱10 min。吸取20 μL血漿移至血凝分析樣品杯底部，預(yù)溫3 min，然后放入測(cè)試通道中，用聯(lián)機(jī)專(zhuān)用微量移液器吸取40 μL相對(duì)應(yīng)的PT試劑后，測(cè)定PT值。

吸取20 μL血漿移至血凝分析儀樣品杯底部，加入20 μL的APTT試劑，置于血凝分析儀樣品預(yù)溫位，預(yù)溫5 min，然后放入測(cè)試通道中，用聯(lián)機(jī)專(zhuān)用微量移液器吸取20 μL的氯化鈣試劑，測(cè)定APTT值。

1.6 血漿中S-華法林和R-華法林濃度的測(cè)定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 S-華法林標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱(chēng)取S-華法林標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。R-華法林標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱(chēng)取R-華法林標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。甲氯噻嗪內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱(chēng)取甲氯噻嗪10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.6.2 色譜條件 手性色譜柱(Astec CHIROBIOTICTMV，5 μm，2.1 mm×100 mm)，柱溫28 ℃，流動(dòng)相5 mmol/L醋酸銨(pH 4.0)∶乙腈=85∶15，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL。

1.6.3 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，負(fù)離子方式檢測(cè)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，毛細(xì)管電壓0.4 kV,去溶劑氮?dú)獾臏囟?00 ℃，流速為650 L/h。華法林用于定量分析的離子碎片m/z為307.1→161.0，錐孔電壓35 V,碰撞能量21 eV；甲氯噻嗪m/z為357.9→321.9，錐孔電壓35 V，碰撞能量14 eV。

2 結(jié)果

2.1 刺五加注射液對(duì)大鼠體內(nèi)華法林抗凝作用的藥效學(xué)影響 用血凝分析儀分別測(cè)定4組大鼠的PT、APTT值，并根據(jù)PT值計(jì)算INR值。APTT Emax用來(lái)表示APTT的峰值，APTT Tmax用來(lái)表示APTT的達(dá)峰時(shí)間。結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2和表1。

圖1 刺五加注射液對(duì)華法林藥效學(xué)影響試驗(yàn)PT變化曲線(xiàn)

組別只數(shù)APTTEmax(s)APTTTmax(h)A組832．14±1．5136(24～48)B組831．99±1．7036(24～48)C組834．96±1．5936(24～48)D組837．37±3．5636(24～48)

2.2 刺五加注射液對(duì)大鼠體內(nèi)華法林抗凝作用的藥動(dòng)學(xué)影響

2.2.1 S-華法林藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及藥時(shí)曲線(xiàn) 華法林對(duì)照組、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組中的S-華法林藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示，藥時(shí)曲線(xiàn)如圖3所示。

圖2 刺五加注射液對(duì)華法林藥效學(xué)影響試驗(yàn)INR變化曲線(xiàn)

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)C組D組Cmax(ng/mL)416．95±43．35494．37±58．09?t1/2(h)32．46±2．0035．30±2．82AUC0?t(ng·h/mL)14231．63±4498．6123914．28±8787．67?AUC0?∞(ng·h/mL)17142．82±4064．6829551．88±9672．99?CL/F[mL/(h·kg)]0．0014±0．000520．0012±0．00045

注：與C組比較，*P<0.05

圖3 華法林對(duì)照組和華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組S-華法林的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)圖

2.2.2 R-華法林藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及藥時(shí)曲線(xiàn) 華法林對(duì)照組、華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組中的R-華法林藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表3所示，藥時(shí)曲線(xiàn)如圖4所示。

表3 刺五加注射液與華法林聯(lián)合給藥后大鼠R-華法林的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化(n=8)

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖4 華法林對(duì)照組和華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組R-華法林的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)圖

3 討論

本研究從藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)兩個(gè)方面評(píng)價(jià)了刺五加注射液對(duì)華法林抗凝作用的影響。采用血凝分析儀測(cè)定凝血指標(biāo)PT、APTT值，并根據(jù)PT值計(jì)算INR值。通過(guò)對(duì)華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組和華法林對(duì)照組的藥效學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和比較，評(píng)價(jià)刺五加注射液對(duì)華法林抗凝作用的藥效學(xué)影響；應(yīng)用UPLC-MS/MS法聯(lián)合手性色譜柱技術(shù)測(cè)定S-華法林和R-華法林的血漿藥物濃度，用DAS 2.0軟件分別計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，通過(guò)對(duì)華法林-刺五加注射液聯(lián)合給藥組和華法林對(duì)照組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和比較，評(píng)價(jià)刺五加注射液對(duì)華法林抗凝作用的藥動(dòng)學(xué)影響。

由藥效學(xué)研究結(jié)果可見(jiàn)，刺五加注射液給藥組與空白對(duì)照組比較，PT、APTT及INR值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明刺五加注射液本身對(duì)凝血無(wú)影響。而刺五加注射液與華法林聯(lián)合給藥組和華法林對(duì)照組比較，聯(lián)合給藥組的PT值延長(zhǎng)，INR值增大(P<0.01)，APTT峰值盡管沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，提示刺五加注射液使華法林抗凝作用增強(qiáng)，而且主要通過(guò)影響外源性凝血途徑。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，刺五加注射液和華法林聯(lián)用后，可使華法林的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)生改變，其中S-華法林的Cmax升高了18.57%(P<0.05)，

AUC0-t升高了68.04%(P<0.05)，AUC0-∞升高了72.39%(P<0.05)；R-華法林的Cmax升高了29.7%(P<0.01)，t1/2延長(zhǎng)了31.27%(P<0.01)，AUC0-t升高了78.85%(P<0.05)，AUC0-∞升高了88.08%(P<0.05)。提示刺五加注射液可抑制華法林的代謝，且對(duì)S-型和R-型均有影響。華法林為外消旋異構(gòu)體，其S-型和R-型手性對(duì)映體活性不同，代謝途徑亦不同，S-華法林主要經(jīng)CYP2C9酶代謝，R-華法林主要經(jīng)CYP1A2和CYP3A4酶代謝。本課題組前期研究表明，刺五加注射液對(duì)CYP2C9和CYP3A4有抑制作用[7]，與華法林合用時(shí)，可由于其對(duì)CYP450酶的抑制作用而使華法林代謝減慢，抗凝作用增強(qiáng)。

結(jié)合藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)結(jié)果綜合分析，刺五加注射液與華法林聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可減慢華法林代謝而導(dǎo)致INR增大，抗凝作用增強(qiáng)，兩藥聯(lián)用可產(chǎn)生代謝性藥物相互作用，使華法林出血風(fēng)險(xiǎn)增加。提示臨床用藥時(shí)，應(yīng)盡量避免刺五加注射液和華法林聯(lián)合應(yīng)用，以避免出血性不良反應(yīng)的發(fā)生；如必須聯(lián)用，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)，并根據(jù)具體情況調(diào)整華法林劑量。

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Influence of ciwujia injection on anticoagulant effect of warfarin in rats

LI Ting-ting,LIU Yan,FENG Li-ying,LIANG Xiao-ling,ZHAO Hai-feng,LIU Gao-feng*

(Department of Pharmacy,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Key Laboratory of University in Heilongjiang Province,Harbin 150086,China)

Objective To study the effects of ciwujia injection on the pharmacodynamics and pharmacokinetics of warfarin in rats,and to provide reference for rational drug use of combination therapy.Methods Wistar rats were randomly divided into four groups,blank control group (group A),ciwujia injection group (group B),warfarin control group (group C),warfarin combined ciwujia injection group (group D),eight rats in each group.The rats of four group swere administered physiological saline or ciwujia injection (15 mL/kg) by caudal vein for 14 consecutive days.On the 8th day,rats in group A and group B were orally administered with the same dose of physiological saline,and rats in group C and group D were orally administered with warfarin solution (0.2 mg/kg).The blood samples were collected from the caudal veins at different time points.The prothrombintime (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) of the blood samples were determined by coagulation analyzer,and the blood concentrations of S-warfarin and R-warfarin were determined by UPLC-MS/MS.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.Results Ciwujia injection had no effect on PT,APTT and INR,but ciwujia injecion combined with warfarin could increase the blood concentrations of warfarin (including S-type and R-type,P<0.05 orP<0.01)and the valne of PT and INR significantly (P<0.05 orP<0.01).Conclusion Ciwujia injection could decrease the metabolism of warfarin (including S-type and R-type),and increase the anticoagulant effect.Therefore,the combination use of the two drugs should be refrained,in order to avoid the risk of bleeding.Special monitoring should be carried out if the combination therapy is used.

Warfarin;Ciwujia injection;Anticoagulant effect;Drug interactions

2015-08-31

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，哈爾濱

150086

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173659)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511003

*通信作者