蒙古櫟葉中乙烯與松櫟柱銹菌春孢子器成熟的關(guān)系

薛煜 甕岳太 季秀 張琳 劉洋 叢贏

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

責(zé)任編輯:程 紅。

樟子松瘤銹病是一種由松櫟柱銹菌(Cronartium guercuum)引起的枝干病害，在東北不同地區(qū)都有大面積發(fā)生［1］。松櫟柱銹菌是一種轉(zhuǎn)主寄生菌，性孢子、春孢子階段生長(zhǎng)在樟子松(Pinus sylvestris var.mongolica)上，夏孢子、冬孢子階段生長(zhǎng)在蒙古櫟(Quercus mongolica)葉片上。以往的病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)不同林分樟子松瘤銹病的春孢子器成熟期不同，春孢子器的成熟期是否與轉(zhuǎn)主寄主的存在與否及轉(zhuǎn)主寄主葉中某些揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)?這是本課題組關(guān)注的重點(diǎn)。

乙烯是一種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老的內(nèi)源性激素，它既促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)器官的生長(zhǎng)，又能影響開(kāi)花結(jié)實(shí)。從1864年發(fā)現(xiàn)路燈旁邊的樹(shù)木提前落葉的現(xiàn)象開(kāi)始，人們就關(guān)注了乙烯的作用。1901年，俄國(guó)植物生理學(xué)家Neljubow 認(rèn)為照明氣中的乙烯會(huì)引起黑暗中生長(zhǎng)的豌豆苗產(chǎn)生“三重反應(yīng)”，認(rèn)為乙烯是一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［2］。此后科學(xué)家們一直在探索植物體內(nèi)的乙烯合成與調(diào)節(jié)機(jī)制。Gane 在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)面包酵母可以釋放出一種使豌豆苗的生長(zhǎng)受到抑制的氣體，這是最早發(fā)現(xiàn)真菌合成乙烯現(xiàn)象［3］，此后陸續(xù)有研究者發(fā)現(xiàn)微生物也具有合成乙烯的能力，如異養(yǎng)細(xì)菌Escherichia colli，菌根真菌Cenococcum geophilum、Hebeloma crustuliniforme，植物病原真菌Botrytis cinerea、Fusarium oxysporum［4-7］。Kitajima et al.［8］認(rèn)為當(dāng)植物在受到各種不良環(huán)境脅迫(寒冷、高溫、干旱、淹水、鹽漬等)時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生乙烯，這是為了減輕或抵御脅迫而做出的反應(yīng)。乙烯作為啟動(dòng)植物防衛(wèi)反應(yīng)的信號(hào)，可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)一些病原相關(guān)蛋白的產(chǎn)生［8］。為此，本研究測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期蒙古櫟葉中的乙烯質(zhì)量摩爾濃度，并進(jìn)行了松櫟柱銹菌春孢子萌發(fā)試驗(yàn)，以探究松瘤銹病春孢子器成熟與蒙古櫟葉子揮發(fā)的乙烯質(zhì)量摩爾濃度間的關(guān)系，為今后深入研究乙烯在寄主與病原菌互作中所扮演的角色及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為掌握該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、最佳防治時(shí)期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銹孢子器成熟度的分級(jí)及樣品的采集:2014年5月上旬，在大興安嶺塔河林業(yè)局立地條件相同的樟子松林內(nèi)，分別在撫育伐和未撫育伐的林分，各調(diào)查30 株罹患樟子松瘤銹病病株，檢查春孢子器成熟程度。摘取剛展葉5、10、15、30、45、60 d 的蒙古櫟葉片放入冰盒中封口的容器內(nèi)，帶回室內(nèi)待測(cè)。

春孢子器成熟標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí)，未形成春孢子器原基;Ⅱ級(jí)，春孢子器包被已形成;Ⅲ級(jí)，露出黃色成熟的粉狀物——春孢子。

試劑:HgCl2-HClO4混合液的配制，200 mL HClO4和27.15 g HgCl2加水定容至1 L。2 mol·L-1的HCl 溶液，37% HCl 稀釋6 倍。飽和NaCl 溶液，將NaCl 溶于100 mL 水中至不再溶解為止。

1.2 方法

1.2.1 春孢子萌發(fā)試驗(yàn)

分別稱取20 g 蒙古櫟10 天生、5 天生葉片，搗碎，混合到2%瓊脂培養(yǎng)基中，制成10 天生、5 天生葉汁培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基切成2 cm×2 cm 的小塊置于載玻片上。將載玻片擱置在滅菌的培養(yǎng)皿中的玻棒上。培養(yǎng)皿中分別鋪好一層用蒸餾水潤(rùn)濕的脫脂棉，用無(wú)菌毛刷粘取新鮮春孢子輕輕彈落在載玻片上，置室溫下培養(yǎng)12 h，以后每隔3 h 觀察1 次，每次選取3 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。不加葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 蒙古櫟葉片乙烯質(zhì)量摩爾濃度的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)乙烯氣樣的采集:取300 mL HgCl2-HClO4混合液于標(biāo)定容積的輸液瓶中(590 mL)，加橡皮瓶塞密封。取1 mL 乙烯(99.9%)注入輸液瓶中，振蕩2 h，室溫放置24 h。從輸液瓶中抽取1 mL 氣樣，測(cè)定未被吸收的乙烯量。1 mL 乙烯減去未被吸收的乙烯，即為乙烯吸收量。稀釋已吸收乙烯的HgCl2-HClO4混合液1、10、100、500、1 000 倍，用于測(cè)定乙烯釋放量。

標(biāo)準(zhǔn)乙烯和蒙古櫟葉中乙烯的測(cè)定:取1 mL 已吸收標(biāo)準(zhǔn)乙烯的HgCl2-HClO4混合液于標(biāo)定容積的Waters 液譜樣品瓶?jī)?nèi)，加2 mol·L-1HCl 1 mL，迅速擰緊瓶蓋，在混合器上振動(dòng)5 s，置樣品于不同的反應(yīng)條件，取出樣品瓶，用注射器從橡膠蓋處向樣品瓶中注入2 mL 飽和NaCl 溶液，同時(shí)另一注射器抽取2 mL 氣樣，待測(cè)。

取蒙古櫟葉5 g，迅速投入裝有12 mL HgCl2-HClO4混合液的試管中，使蒙古櫟葉完全浸沒(méi)于反應(yīng)液中，20 h 后轉(zhuǎn)入研缽中研磨，于12 000 r·min-1離心10 min。取上清液2 mL 于Waters 液譜樣品瓶中。加2 mol·L-1HCl 1 mL，迅速擰緊瓶蓋，在混合器上振動(dòng)5 s，放入30 ℃水浴保溫5 h。取出樣品瓶，用注射器從橡膠蓋處向樣品瓶中注入2 mL 飽和Nacl 溶液，同時(shí)另一注射器抽取2 mL 氣樣，待測(cè)。

待測(cè)樣品的乙烯質(zhì)量摩爾濃度用島津-mini 3型氣相色譜儀測(cè)定，色譜柱4 mm×2 000 mm，G.D.X.502，載氣為氮?dú)?，氫火焰離子檢測(cè)器，柱溫70 ℃。每個(gè)測(cè)定3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林分中松櫟柱銹菌春孢子器形成情況

從表1可以看出，5月中旬，在經(jīng)過(guò)撫育伐的樟子松林內(nèi)，其病株上的春孢子器均未成熟，絕大多數(shù)剛剛形成春孢子器原包被。而在未經(jīng)過(guò)撫育伐的樟子松林內(nèi)，林下蒙古櫟已開(kāi)始展葉，除2 株沒(méi)有形成春孢子器外，其他28 株病株均已形成春孢子器，揭開(kāi)樹(shù)皮，可見(jiàn)黃色的春孢子粉。

表1 不同林分松櫟柱銹菌春孢子成熟度調(diào)查(n=30 株)

2.2 蒙古櫟葉汁對(duì)春孢子萌發(fā)的影響

春孢子在加蒙古櫟葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基中萌發(fā)率明顯高于未加蒙古櫟葉汁的;而在較老(10 天生)的蒙古櫟葉汁(乙烯質(zhì)量摩爾濃度193.596 nmol·g-1)的培養(yǎng)基上的萌發(fā)率又高于較嫩(5 天生)的蒙古櫟葉汁(乙烯質(zhì)量摩爾濃度993.168 nmol·g-1)的培養(yǎng)基，其萌發(fā)率最高可達(dá)84.07%;在未加蒙古櫟葉汁的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，最高只達(dá)56.06%(表2，圖1)。

表2 松櫟柱銹菌春孢子在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率 %

圖1 春孢子在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)狀

2.3 蒙古櫟不同發(fā)育期乙烯質(zhì)量摩爾濃度

乙烯標(biāo)準(zhǔn)品和蒙古櫟葉樣品的氣相色譜圖見(jiàn)圖2。通過(guò)數(shù)據(jù)處理求得在第4 分鐘時(shí)的峰值為乙烯峰值，展葉5 d 和展葉10 d 的樣品乙烯質(zhì)量摩爾濃度分別為993.168、193.596 nmol·g-1，其他組的峰值逐漸變小，以至趨于恒定(圖3)。由此可以說(shuō)明，蒙古櫟葉從萌芽開(kāi)始，隨著葉子的生長(zhǎng)發(fā)育，乙烯的質(zhì)量摩爾濃度不斷降低，并趨于一個(gè)穩(wěn)定的值。結(jié)合松櫟柱銹菌春孢子萌發(fā)情況，可證實(shí)蒙古櫟葉汁明顯促進(jìn)了松櫟柱銹菌春孢子的萌發(fā)，且10 天生葉比5 天生葉促進(jìn)萌發(fā)的效果更佳。這也意味著松櫟柱銹菌在10 天生的櫟葉上侵染機(jī)會(huì)最多，這時(shí)櫟葉的被動(dòng)抗性結(jié)構(gòu)還未健全，乙烯質(zhì)量摩爾濃度又恰好適于春孢子萌發(fā)定植。

圖2 乙烯標(biāo)準(zhǔn)品(a)和蒙古櫟葉樣品(b)的氣相色譜圖

圖3 不同展葉天數(shù)的蒙古櫟葉樣品的氣相色譜圖

3 結(jié)論與討論

Cronartium guercuum 是一種比較古老的銹菌，在病原菌與寄主長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，已有了某種默契。蒙古櫟在展葉時(shí)，正是松櫟柱銹菌成熟時(shí)，它為了保護(hù)自身的安全，增強(qiáng)防御病原菌和其他生物的侵襲，而生產(chǎn)大量乙烯，但也可能正是其發(fā)散出的大量乙烯，又給Cronartium guercuum 傳導(dǎo)了有了新“獵物”的信息，從而促進(jìn)了春孢子器的成熟。Cristeseu et al.［6］等已證實(shí)植物受到病原微生物侵染后會(huì)在體內(nèi)積累大量的乙烯，這說(shuō)明寄主和病原菌之間是有感應(yīng)的。Baldwin 和Schultz［9］在研究中也發(fā)現(xiàn)植物在受到外界傷害后往往會(huì)釋放大量的植物揮發(fā)性有機(jī)化合物，而其周圍的健康植物能夠感受到這種信息，并積極地表達(dá)抗性基因和產(chǎn)生防御物質(zhì)，鄰近健康植物的乙烯信號(hào)途徑在植物-植物交流過(guò)程中是不可或缺的，茉莉酸信號(hào)起到了輔助和信號(hào)放大的作用。于延文等［10］也認(rèn)為在植物的抗病反應(yīng)中，乙烯是植物防衛(wèi)反應(yīng)的報(bào)警信號(hào)物質(zhì)并參與防衛(wèi)反應(yīng)。張晟瑜［11］在研究中發(fā)現(xiàn)，乙烯對(duì)灰霉菌的孢子萌發(fā)無(wú)顯著影響，但是對(duì)灰霉菌的菌絲生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。1～1 000 mg·kg-1的外源乙烯都不同程度地促進(jìn)了灰霉菌菌絲的伸長(zhǎng)，其中1 mg·kg-1處理8 h 后，Bot 0023 和Bot 0024 菌株的發(fā)芽管伸長(zhǎng)速度分別是對(duì)照組的11.451、15.098 倍。寄主葡萄的營(yíng)養(yǎng)可誘導(dǎo)灰霉菌合成乙烯，1～50 mg·kg-1的乙烯可顯著(p＜0.05)促進(jìn)灰霉菌菌絲的生長(zhǎng)、增強(qiáng)其對(duì)果實(shí)的致病性［10］。

經(jīng)過(guò)撫育伐的樟子松林，林下無(wú)蒙古櫟，松櫟柱銹菌的春孢子器形成的時(shí)間要比未經(jīng)過(guò)撫育伐的樟子松林晚一周左右。在未經(jīng)撫育伐的樟子松林中，蒙古櫟叢生，也許是蒙古櫟為保護(hù)自已而散發(fā)的乙烯反而催熟了松櫟柱銹菌的春孢子器，使其提早成熟。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，春孢子器并不是每年全部發(fā)生，在撫育伐的樟子松林中，都發(fā)現(xiàn)有未形成春孢子器的病株。這是否和性孢子器當(dāng)年的受精情況和春孢子器在發(fā)育過(guò)程中受到某種外界干擾而停止發(fā)育有關(guān)，還是春孢子器形成也有某些年份間歇的特性，這些尚未被人們所認(rèn)識(shí)，其原因還有待今后繼續(xù)長(zhǎng)期定點(diǎn)定株觀察和深入研究。

松櫟柱銹菌在加入蒙古櫟葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)好，而較老葉(10 天生)比較嫩葉(5 天生)更好，在未加蒙古櫟葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，比較老葉低33.3%，比較嫩葉低22.6%。乙烯對(duì)春孢子萌發(fā)有明顯地促進(jìn)作用，而且還和乙烯的質(zhì)量摩爾濃度有關(guān)。乙烯質(zhì)量摩爾濃度在193.596 nmol·g-1(展葉10 d)好于993.168 nmol·g-1(展葉5 d)，這充分證實(shí)乙烯在春孢子萌發(fā)中具有催熟的重要的生理和生態(tài)學(xué)意義。乙烯還可促進(jìn)許多植物種子，如谷物、油料(花生、油菜)等以及某些雜草的萌發(fā)，還能促進(jìn)塊莖、鱗莖、球莖以及休眠芽萌發(fā)［12］。

蒙古櫟葉中乙烯質(zhì)量摩爾濃度的峰值在嫩葉(5 天生)時(shí)最高，是較老葉(10 天生)的5 倍，隨著葉齡的增加，乙烯質(zhì)量摩爾濃度迅速下降，并趨于恒定。這可能和寄主防御能力的逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞壁和角質(zhì)層已逐漸增厚，乙烯防御作用相對(duì)減弱，這也是寄主的一種自我調(diào)解能力。

致謝:參加本項(xiàng)工作的還有駱荻、劉豪果、王旭彤、馬麗娜同志，在此表示感謝。

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