唾液β-葡萄糖醛酸苷酶與慢性牙周炎相關(guān)性研究

黃滿英，付　云，劉　瑜

(1．安徽省合肥市第二人民醫(yī)院口腔科，安徽 合肥　230011；

2.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科，廣東 廣州　510055)

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唾液β-葡萄糖醛酸苷酶與慢性牙周炎相關(guān)性研究

黃滿英1，付云2，劉瑜1

(1．安徽省合肥市第二人民醫(yī)院口腔科，安徽 合肥230011；

2.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科，廣東 廣州510055)

摘要：目的檢測慢性牙周炎患者唾液β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，β-G)水平，并與治療后及健康人群對照，以期明確β-G與慢性牙周炎的關(guān)系，為牙周炎診斷及療效監(jiān)測提供有效參考。方法選擇18名慢性牙周炎患者，采集牙周基礎(chǔ)治療前及治療后全唾液并記錄牙周臨床指數(shù)；檢測全唾液中β-G(比色法)水平，并分析與牙周臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果(1)基礎(chǔ)治療后，牙周臨床參數(shù)改善明顯(P<0.05)；(2)治療前實驗組唾液β-G活性水平(2.845±0.72，10-3U·mL-1)與健康對照組(2.24±0.31，10-3U·mL-1)差異有顯著性(P<0.05)，與平均牙周袋深度(r=0.485)、深袋數(shù)(r=0.540)、深袋構(gòu)成比(r=0.598)之間明顯相關(guān)(P<0.05)；治療后β-G酶活性水平(2.18±0.71，10-3U·mL-1)明顯下調(diào)(P<0.05)，與對照組差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論唾液β-G活性水平能在一定程度上反映當(dāng)前牙周炎狀態(tài)及控制程度，該指標可為牙周炎診斷和療效監(jiān)測提供參考。

關(guān)鍵詞：β-葡萄糖醛酸苷酶；慢性牙周炎；唾液

牙周炎是由牙周病原菌和宿主免疫機制及環(huán)境因素之間通過復(fù)雜的相互作用造成組織損害的炎性疾病。其特征性表現(xiàn)是免疫細胞與炎癥因子在牙周組織中聚集以及牙周支持組織喪失。流行病學(xué)調(diào)查顯示牙周病發(fā)病率在中年人人群中約23.2%，老年人人群中約37.4%。

牙周病診斷技術(shù)包括臨床檢查、放射檢查、細菌學(xué)檢查、基因檢查和生化檢查等。生化檢查的標本主要包括唾液、齦溝液和血液，唾液標本因收集簡便、無創(chuàng)，處理方法簡單，更適合作為椅旁快速診斷或大范圍流行病學(xué)研究[1]。Hady Haririan等用PCR方法檢測侵襲性牙周炎和慢性牙周炎患者唾液標本和齦下菌斑標本中的細菌，兩種標本細菌檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異[2]，說明唾液標本與齦溝液標本同樣具有研究意義。同時全唾液成分包括宿主來源的蛋白、宿主細胞、激素(皮質(zhì)醇)、細菌以及細菌產(chǎn)物、離子和揮發(fā)性氣體，這些物質(zhì)不僅包含牙周局部信息還能傳遞系統(tǒng)信息，而牙周炎與全身狀況密切相關(guān)，通過對唾液成分的分析和研究有可能揭示其所表達的各種信息，從而有助于對疾病做出更全面客觀的診斷。

本研究通過檢測牙周炎患者全唾液β-G治療前、后水平，以及其與牙周臨床參數(shù)間的相關(guān)性，并與牙周健康對照組比較，以期明確β-G與牙周炎臨床狀態(tài)的關(guān)系，為牙周炎診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評估提供依據(jù)。

1資料和方法

1.1研究對象實驗組：選取某口腔醫(yī)院牙周科就診患者18名(男12名，女6名)，年齡24～48歲，平均年齡(35.11±7.27)歲。納入標準[3]：(1)明確診斷為慢性牙周炎者，診斷標準見《牙周病學(xué)》(曹采芳 主編.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社)；(2)口腔內(nèi)無未充填活動性齲齒，缺失牙數(shù)小于5顆(不含第三磨牙)；(3)無口腔黏膜疾病，無根尖瘺管；(4)無遺傳性疾病及全身系統(tǒng)疾病；(5)3個月內(nèi)無使用抗生素及免疫抑制劑；(6)近2年內(nèi)無牙周治療史；(7)無重度吸煙史、非妊娠者。 對照組8名(男4名，女4名)，年齡26～44歲，平均年齡(34.75±6.56)歲。牙列完整，無附著喪失，牙齦色、形、質(zhì)正常，并符合(2)～(7)標準。

1.2實驗儀器和試劑(1)Florida 牙周探針(Florida Probe，USA)；(2)多功能P5超聲波牙科治療儀(Suprasson，F(xiàn)rance )；(3)Gracey刮治器 (Densplay，USA)；(4)內(nèi)源性β-葡萄糖醛酸苷酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；(5) TECAN酶標儀(TECAN，Swiss Confederation)；(6)Biofuge Stratos高速離心機 (Sorvall，Germany)。

1.3實驗方法

1.3.1唾液標本的采集[4]所選實驗對象進行全口齦上潔治拋光，雙氧水沖洗牙周袋，口腔衛(wèi)生宣教，預(yù)約一周后復(fù)診。復(fù)診時間定于上午9：00～11：00，采集前禁食1 h，并以蒸餾水含漱2次。每5 min輕吐唾液至無菌收集管，此過程避免吮吸，血污染樣品棄去，重新采集。5 mL無菌注射器收集1.5 mL清亮液體至無菌EP管，-20℃保存，3 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室，-80℃凍存，待測?；A(chǔ)治療后一月復(fù)診，唾液采集過程同上。

1.3.2牙周臨床參數(shù)檢查采用Florida探針，記錄觀察全口牙近頰、頰側(cè)、遠頰、近舌、舌側(cè)、遠舌6個位點探診深度(probing depth，PD)、附著喪失(clinical attachment loss，CAL)及探診出血(bleeding on probing，BOP)，以SBOP(+)表示探診出血陽性位點數(shù)，PD≤4 mm為淺袋，46 mm為深袋。

1.3.3牙周基礎(chǔ)治療繼唾液標本采集、牙周臨床檢查后，P5超聲齦下工作尖+Gracey刮治器全口分區(qū)局麻下刮治、根面平整，雙氧水沖洗，術(shù)后不予抗生素輔助治療。

1.3.4唾液β-G檢測唾液標本-20℃、4℃逐步解凍，10 000×g低溫離心10 min，取上清0.05 mL。根據(jù)內(nèi)源性β-葡萄糖醛酸苷酶測定試劑盒(南京建成生物研究所)提供實驗步驟加樣(比色法)，37℃避光反應(yīng)1 h，加終止液，3 500×g離心10 min，540 nm紫外光、1 cm光徑蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度(OD)值。以0.05 mL雙蒸水為空白對照，1 mmol·L-1酚酞標準液為標準管，同樣測OD值。以37℃條件下，每分鐘能催化生成1 μmol·L-1酚酞的酶量為一個活性單位(U)，如公式(1)所示。

(1)

2結(jié)果

2.1實驗組治療前后牙周臨床參數(shù)比較如表1所示，平均探診深度、平均附著喪失、探診出血位點構(gòu)成比、深袋構(gòu)成比、中袋構(gòu)成比經(jīng)配對t檢驗分析，與初診水平差異有顯著性。其中牙周袋構(gòu)成比變化差異大，深袋構(gòu)成比從(11.76±10.72)%減少至(2.78±3.22)%，中袋構(gòu)成比從(27.06±10.04)%減少至(13.20±8.28)%，如圖1所示。

表1　基礎(chǔ)治療前、后牙周臨床參數(shù)比較

2.2唾液β-G活性水平組間比較牙周炎患者治療前唾液中β-G活性水平(2.85±0.72)10-5U·L-1高于健康對照組(2.24±0.31)10-5U·L-1、，差異有顯著性(P<0.05)；治療后β-G活性水平(2.18±0.71)10-5U·L-1與治療前相比顯著下調(diào)(P<0.05)，與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

如圖2所示，β-G活性水平95%置信區(qū)間組間比較，實驗組治療前(2.49～3.20，10-5U·L-1)明顯高于對照組(1.99～2.50，10-5U·L-1)，與對照組僅有極小部分重疊，治療后β-G活性水平95%置信區(qū)間(1.78～2.57，10-5U·L-1)完全包括對照組β-G活性范圍。

圖1基礎(chǔ)治療前、后牙周袋分布比較

圖2唾液β-G活性95%置信區(qū)間組間比較

2.3唾液β-G活性水平與牙周臨床參數(shù)相關(guān)性如表2所示，唾液β-G活性水平與牙周臨床參數(shù)相關(guān)性分析顯示：實驗組治療前β-G活性水平與平均探診深度(MPD)、深袋數(shù)、深袋構(gòu)成比顯著相關(guān)，與其他牙周臨床參數(shù)不相關(guān)；基礎(chǔ)治療后，唾液β-G活性與牙周臨床參數(shù)均不相關(guān)。

牙周基礎(chǔ)治療后，唾液β-G下調(diào)量與MPD減小量明顯相關(guān)(r=0.621，P=0.013)。

表2　唾液β-G活性與牙周臨床參數(shù)相關(guān)分析(r值)

注：*P<0.05。

3討論

牙周病的主要發(fā)病機制是牙周菌斑內(nèi)有關(guān)致病菌產(chǎn)生的可溶性物質(zhì)直接毒害組織細胞，或破壞細胞間質(zhì)以及激活宿主的炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，在此過程中會產(chǎn)生大量的超氧化物、酶類或其他免疫因子。多項研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者唾液或齦溝液中酶的活性與牙周組織破壞程度相關(guān)[5-6]，而β-G作為溶酶體釋放的內(nèi)源性水解酶，主要參與細胞外基質(zhì)以及基底膜蛋白多糖類物質(zhì)的降解，在牙周炎發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用，有研究表明，慢性牙周炎和牙齦炎患者外周血白細胞在細菌抗原刺激下β-G的活性明顯增強[7]，并且1-型糖尿病伴牙周炎患者外周血白細胞在外界抗原刺激下β-G活性比單純牙周炎患者β-G活性強[8]。細胞體外實驗研究表明，細菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)能抑制細胞有氧呼吸，導(dǎo)致乳酸釋放，改變局部pH值，從而增強β-G活性[9]。以上研究表明，β-G活性與局部環(huán)境中細菌量和細菌毒力密切相關(guān)，同時與機體對抗原免疫反應(yīng)的強度相關(guān)。

本實驗中，牙周炎患者唾液β-G活性水平與牙周健康者相比明顯升高，治療后β-G活性下調(diào)，且牙周炎控制水平與β-G活性下調(diào)程度正相關(guān)。支持Zambon等關(guān)于慢性牙周炎患者唾液β-G活性的研究結(jié)果[10-12]，同時與慢性牙周炎患者齦溝液β-G活性的研究結(jié)果[13-14]也一致。以上結(jié)果表明，無論在唾液標本還是齦溝液標本中，β-G活性與當(dāng)前牙周狀態(tài)密切相關(guān)，是牙周炎發(fā)展和控制與否的指示性物質(zhì)。

通過對組間β-G活性水平比較還發(fā)現(xiàn)：實驗組治療前唾液β-G 活性95%置信區(qū)間(2.49～3.20，10-5U·L-1)與對照組(1.99～2.50，10-5U·L-1)差異顯著，僅存在極小部分重疊(圖2)。Zambon等[10]對380名牙周炎患者唾液β-G活性水平研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)以40 IU/50 μL-1為臨界點時，對牙周炎(至少4個位點PD≥5 mm)診斷敏感性達91.3%，以100 IU/50 μL-1為臨界點時，對牙周炎診斷特異性達84.9%。因此推測：可通過確定某一界限范圍將唾液β-G活性作為牙周炎初步篩查和大范圍人群普查的指標之一。但如何確定這一臨界點尚需要進一步大樣本量的研究。

本實驗中治療前β-G與平均袋深、深袋位點數(shù)、深袋百分比相關(guān)(表2)。支持Lamster等[9]研究結(jié)論，該實驗中唾液β-G活性與平均探診深度和深袋(PD ≥5 mm)位點數(shù)顯著相關(guān)，當(dāng)唾液中β-G活性≥100 IU時，其有4個位點深袋的風(fēng)險值是3.77。同時，Ishisaka等[8]發(fā)現(xiàn)外周血白細胞β-G活性與牙周臨床參數(shù)也相關(guān)，進一步表明β-G與牙周炎當(dāng)前炎癥程度相關(guān)，是牙周炎發(fā)展的指示性物質(zhì)。

本研究結(jié)果提示：唾液β-G活性水平能在一定程度上反映當(dāng)前牙周炎狀態(tài)及炎癥控制程度，該指標可為牙周炎診斷和療效監(jiān)測提供有效參考，但具體活性值以及在何種標本中更能真切反應(yīng)牙周狀態(tài)尚待進一步研究。

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Study of the correlation between salivary levels of

β-G and chronic periodontitis

HUANG Man-ying1,FU Yun2,LIU Yu1

(1.DepartmentofStomatology,TheSecondPeople'sHospitalofHefei,Hefei230011,China;

2.DepartmentofPeriodontology,TheAffiliatedStomatologicalHospitalofGuanghuaSchool

ofDentistry,ZhongshanUniversity,Guangzhou510055,China)

Abstract:ObjectiveThe aims of study were to investigate the changes of the salivary levels ofβ-G in patients with chronic periodontitis before and after initial periodontal therapy,and evaluate the relationship between the content of the enzyme and periodontal clinical parameters.MethodsEighteen patients with moderate to severe chronic periodontitis were selected.They first underwent supragingival scaling and oral health instruction (OHI).A week later,non-stimulated whole saliva was collected and periodontal clinical parameters were examined and the patients were treated with subgingival scaling and root planning.The salivaryβ-G was examined by flourometric assay.A month later,the salivary levels of β-G were reevaluated.ttest was used to analyze the differences of salivary enzymes levels and periodontal parameters before and after initial periodontal therapy; pearson correlation was used to analyze the correlation between the levels of enzymes and periodontal parameters.Results(1) The changes in the clinical periodontal variables were significant following initial periodontal therapy;(2) At baseline,the salivaryβ-G activity of chronic periodontitis patients was statistically higher than that of controls (P<0.05),and correlated significantly with mean probing depth (MPD) and the number of sites with probing depth ≥6 mm.Following initial periodontal therapy,the salivaryβ-G activity decreased significantly.Conclusion The salivary β-G activity could be a reflection of current status of chronic periodontitis.The detection of the enzyme may therefore aid clinician in the diagnosis and therapeutic evaluation of the disease.

Key words:β-glucuronidase (β-G);saliva;chronic periodontitis

(收稿日期：2014-05-21，修回日期：2014-09-11)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.041