GRP78與CHOP在缺血再灌注損傷中的作用

秦　勤，李元海

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥　230022)

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GRP78與CHOP在缺血再灌注損傷中的作用

秦勤，李元海

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥230022)

摘要:缺血再灌注(ischemia-reperfusion ,IR)過程中多種因素可導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress response,ERS)，ERS參與缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,IRI)的發(fā)展過程?？偨YERS抗凋亡標志物GRP78與促凋亡標志物CHOP在IRI中的作用。IRI時GRP78與CHOP表達的變化及其作用。明晰GRP78與CHOP參與IRI的機制。

關鍵詞:GRP78；CHOP；缺血再灌注損傷

各種原因造成組織或器官血液灌流量減少時發(fā)生缺血性損傷，而恢復血液灌流后，細胞結構及功能破壞反而加重，這種缺血組織或器官重獲血流灌注后損傷加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)。IRI發(fā)病因素包括缺血再灌注(ischemia- reperfusion,IR)過程中出現(xiàn)的葡萄糖匱乏、活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多及鈣穩(wěn)態(tài)的破壞,這些因素均可導致內質網蛋白折疊功能受損，未折疊及錯誤折疊蛋白質在內質網腔內聚集，引發(fā)內質網應激(endoplasmic reticulum stress ,ERS)，為恢復細胞功能發(fā)生未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR),GRP78作為抗凋亡標志物在UPR發(fā)生后表達增加，促進內質網穩(wěn)態(tài)、細胞結構及功能的恢復，在IR過程中引起ERS的刺激持續(xù)存在，ERS過強細胞結構及功能無法恢復，引起細胞死亡蛋白之一在ERS持續(xù)存在時表達增加，促進細胞凋亡，加重組織器官損傷。本文就IRI時GRP78與CHOP表達的變化及其作用做一綜述。

1IR過程中可導致ERS發(fā)生的因素

1.1葡萄糖匱乏在IR中的缺血期葡萄糖匱乏，葡萄糖匱乏可引起ERS的發(fā)生,GRP78和CHOP表達均增加[1]。這一現(xiàn)象與葡萄糖匱乏導致細胞內ATP生成減少和內質網腔內蛋白質糖基化受抑，影響內質網蛋白折疊功能，引起未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白在內質網腔聚集有關。

1.2活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多Tsuda H等[2]發(fā)現(xiàn)抑制IR過程中ROS的產生可降低GRP78、CHOP的表達，說明在IRI過程中ROS的增多可引起ERS。IR過程中ROS的來源有黃嘌呤脫氫酶系統(tǒng)[2]、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統(tǒng)、線粒體電子傳遞復合體功能受損增多的電子漏[3]、線粒體通透性轉換孔( mitochondrial permeability transition pore ,MPTP)開放產生活性氧導致的活性氧釋放現(xiàn)象[4]等，IRI時ROS來源增多，而超氧化物歧化酶活性降低[3],細胞內ROS清除減少，因此細胞內ROS大量聚集。一方面ROS改變Ca2+釋放通道1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol-1,4,5 -triphosphatereceptor,IP3R)構象促進內質網Ca2+釋放,抑制內質網上Ca2+泵活性影響細胞質內Ca2+再攝取入內質網[5]，導致內質網內Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂。另一方面ROS可攻擊維持蛋白折疊酶活性所必需的游離巰基，使內質網腔蛋白折疊酶功能異常，蛋白折疊障礙，未折疊蛋白積聚并滯留于內質網腔。內質網內Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂及未折疊蛋白積聚均可導致ERS的發(fā)生。

1.3內質網內Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂內質網是貯存Ca2+、維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要細胞器之一，IR時內質網腔內Ca2+穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。在Na+-K+-Cl-共同轉換體、Na+/Ca2+交換體、IP3R共同作用下內質網內Ca2+在IR過程中呈現(xiàn)兩種時相：缺血期氧-糖剝奪狀態(tài)(oxygen-glucose deprivation ,OGD)下內質網內Ca2+超載，復氧后內質網內Ca2+向細胞質釋放，出現(xiàn)Ca2+耗竭，內質網內Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂可損害內質網蛋白折疊功能，未折疊蛋白在內質網積聚，引發(fā)ERS[6]。

2GRP78與IRI

2.1GRP78概述葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)是熱休克蛋白70家族成員之一[7]又名免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,BIP)。它由具有ATP酶活性的ATP結合域、多肽結合域和活性調節(jié)域組成。生理狀態(tài)下GRP78功能包括作為分子伴侶在內質網內與新生多肽以非共價鍵形式短暫地結合,促進蛋白質的正確折疊和裝配,并協(xié)助蛋白質跨內質網膜轉運；作為Ca2+結合蛋白與Ca2+結合，調節(jié)內質網內Ca2+濃度；與內質網常駐跨膜蛋白：RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(RNA dependent protein kinase-like ER kinase ,PERK)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6 ,ATF6)、肌糖需酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)結合使這些跨膜蛋白處于無活性狀態(tài)。

2.2GRP78表達增加途徑在IR過程中細胞葡萄糖和ATP匱乏、ROS增多及內質網內Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂綜合作用下內質網腔內未折疊蛋白大量聚集，GRP78與PERK、ATF6、IRE1解離，PERK與GRP78解離后發(fā)生自身磷酸化、二聚化而活化，活化后的PERK磷酸化eIF2α使之活化，抑制細胞內大多數(shù)蛋白的合成，而ATF4mRNA優(yōu)先翻譯，ATF4作為轉錄因子促進ERS相關蛋白的表達，如GRP78。ATF6與GRP78解離后轉移至高爾基體，被高爾基體常駐蛋白酶裂解，釋放基本的亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper ,bZIP) 轉錄因子促進包括GRP78的ERS反應原件的表達[8]。與GRP78解離的IRE1通過寡聚化及自身磷酸化而活化[9]，活化后的IRE1剪切X盒結合蛋白-1(Xbox binding protein 1,XBP-1)mRNA前體，翻譯成轉錄因子XBP-1，促進GPR78的表達[8]。

2.3GRP78減輕IRILi H等發(fā)現(xiàn)選擇性下調GRP78表達將增強視網膜IRI[10]。GRP78可通過以下方面減輕IRI。

2.3.1幫助蛋白正確折疊當未折疊蛋白中內質網腔內聚集時，GRP78與PERK、ATF6、IRE1解離，幫助未折疊蛋白正確折疊[11]。GRP78多肽結合域與未折疊蛋白結合，ATP酶結合域促進蛋白折疊,GRP78還具有轉移內質網腔內錯誤折疊蛋白功能，使細胞中應激狀態(tài)下蛋白質繼續(xù)合成。

2.3.2抑制ROS引起的脂質過氧化GRP78可促進琨氧化還原酶抗體(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)表達,還可促進還原性谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)的表達、抑制GSH的清除，NQO1及GSH均是細胞內的抗氧化劑，促進ROS的清除，促進細胞氧化還原狀態(tài)的平衡，抑制脂質過氧化[12]。

2.3.3抑制內質網Ca2+滲漏易位子(translocon,TLC)是內質網膜上的Ca2+滲漏通道，正常情況下GRP78覆蓋在TLC上參與內質網內Ca2+穩(wěn)態(tài)的調節(jié)，在發(fā)生未折疊蛋白反應時GRP78與TLC分離，Ca2+滲漏增加，加重內質網Ca2+耗竭，在GRP78表達增多后，GRP78與TLC結合，使TLC關閉，抑制內質網Ca2+滲漏[13]。

2.3.4抑制胱冬酶(caspase)-12 激活在ERS下， caspase-7和caspase-12 相互作用，使caspase-12 裂解、激活，激活的caspase-12 引起ERS特異的細胞凋亡。在內質網應激初期,GRP78與caspase-7和caspase-12 形成復合物,抑制caspase-12激活及其從內質網釋放,從而抑制caspase-12 激活相關細胞凋亡。

3CHOP與IRI

3.1CHOP概述CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins homologous protein,CHOP)是CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)家族中的一員，又名生長停滯及DNA損傷基因153(growth arrestand DNA damage-inducible gene 153 ,GADD153)。生理狀態(tài)下CHOP以很低的表達水平存在于細胞質中。當ERS持續(xù)存在時，CHOP的表達上調，促進細胞凋亡。

3.2CHOP表達增加途徑ERS發(fā)生后PERK、ATF6、IRE1活化產生的轉錄因子ATF4、bZIP和XBP-1均可上調CHOP的表達，其中最重要的通路是PERK-磷酸化eIF2α-ATF4-CHOP通路。

3.3CHOP促進IRICHOP作為促凋亡轉錄因子，是介導ERS導致的細胞凋亡中至關重要的蛋白之一。Rao J等發(fā)現(xiàn)運用脂多糖預處理抑制肝細胞ATF4-CHOP通路及敲除ATF4基因顯著減少CHOP表達均可抑制肝細胞凋亡，抑制IRI[14]，Yang JR等發(fā)現(xiàn)沉默CHOP表達可減輕IR導致的腎小管細胞凋亡[15]。CHOP可通過以下方面促進IRI。

3.3.1上調caspase-11表達[15]CHOP可上調caspase-11表達，caspase-11裂解caspase-1前體，激活caspase-1，激活的caspase-1可促進細胞炎癥介質的釋放及程序性細胞死亡。

3.3.2上調GADD34基因表達CHOP上調生長停滯與DNA損害可誘導基因34(growth arrest and DNA damage-inducible protein 34，GADD34)表達，GADD34使eIF2α在絲氨酸51位點脫磷酸化，導致細胞從蛋白翻譯廣泛受抑狀態(tài)恢復[16]，蛋白翻譯增多，導致更多未折疊蛋白在內質網中積聚及促凋亡蛋白的增多。

3.3.3上調內質網氧化酶-1α(endoplasmic reticulum oxidase-1α,ERO1α)表達ERO1α是內質網內一種氧化酶，CHOP可上調ERO1α的表達[17]，ERO1α表達上調一方面導致內質網內過氧化狀態(tài)，增加內質網內錯誤折疊蛋白水平。另一方面激活IP3R使過多的Ca2+從內質網釋放到線粒體中，促發(fā)細胞死亡。

3.3.4誘導腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體受體-2(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand Receptor-2,TRAILR2)的表達腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體(Tuoxidasemor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand ,TRAIL)是腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超家族中的一員，主要作用是誘導細胞凋亡，TRAIL的作用主要受TRAIL受體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor,TRAILR)調控[18]，TRAIL與TRAILR2結合導致TRAILR2寡聚化并募集FAS死亡結構域相關蛋白(FAS-associated protein with death domain,FADD)至TRAILR2羧基端的死亡結構域，導致caspase-8和caspase-10的聚集，形成多蛋白死亡誘導信號復合體。

3.3.5抑制B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)基因轉錄Bcl-2基因編碼的Bcl-2蛋白屬膜整合蛋白，定位于線粒體、內質網和連續(xù)的核周膜，是細胞存活促進因子，CHOP可抑制Bcl-2基因轉錄[19]，Bcl-2基因轉錄受抑導致細胞內硫醇耗竭，使細胞對可導致細胞死亡的刺激因素更為敏感，對有的細胞來說硫醇耗竭足以導致細胞凋亡。Bcl-2轉錄受抑還影響細胞內GSH穩(wěn)態(tài)，在有些細胞中細胞內GSH穩(wěn)態(tài)與細胞凋亡的調節(jié)密切相關。

3.3.6誘導與Bcl-2相互作用的細胞死亡調解子(Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim)的表達[20]Bim是Bcl-2家族中唯BH3同源結構域亞家族的成員,廣泛分布于機體各種組織中，是一種重要的凋亡調節(jié)蛋白，具有促凋亡的活性。夏珍等發(fā)現(xiàn)明Bim通過內質網途徑介導缺氧導致的心肌細胞凋亡[20]。CHOP和CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT enhancer bindingproteins α,C/EBPα)共同與Bim基因第一個內含子區(qū)某一位點結合促進Bim的表達，促進細胞凋亡。

4結語與展望

IR過程中葡萄糖匱乏、ROS增多及Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂均可導致ERS的發(fā)生，通過UPR的三條通路GRP78表達增加，GRP78幫助細胞內穩(wěn)態(tài)的恢復、抑制細胞凋亡而減輕IRI。由于IR時引起ERS的刺激持續(xù)存在，ERS過強細胞內穩(wěn)態(tài)難以恢復，CHOP等促凋亡轉錄因子表達增加，通過下游信號通路促進細胞凋亡的發(fā)生加重IRI。目前我們對GRP78和CHOP在IRI發(fā)生發(fā)展中的作用的理解仍有限，未來隨著IRI、ERS、GRP78及CHOP研究的深入我們將更全面掌握它們之間的關系，并可能發(fā)現(xiàn)通過改變GRP78及CHOP表達從而減輕IRI的方法。

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The role of GRP78 and CHOP in ischemia-reperfusion injury

QIN Qin,LI Yuan-hai

(DepartmentofAnesthesiology，TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Abstract:A variety of factors in ischemia-reperfusion(IR) can result in endoplasmic reticulum stress response(ERS),and ERS participates in the development process of ischemia-reperfusion injury(IRI).To summarize the role of anti-apoptotic mark GRP78 and pro-apoptotic mark CHOP in IRI.The expression and function of GRP78 and CHOP in IRI.Clarify the mechanism of GRP78 and CHOP participation in IRI.

Key words:GRP78; CHOP; ischemia-reperfusion injury

作者簡介：姜文青,女,碩士研究生

(收稿日期：2014-06-21，修回日期：2014-07-18)

通信作者：李元海,男，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：危重癥學，E-mail:liyuanhai-1@163.com 張亞中,男,碩士生導師,副主任中藥師,研究方向：中藥質量標準研究，E-mail: yazhongzhang@hotmail.com

基金項目：安徽省科技攻關項目(No 1301042204) 安徽省食品藥品監(jiān)督管理局基金項目(No 20120007);安徽省研究生“千人計劃”基金項目

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.002