miR-126抑制結腸癌增殖及侵襲轉移的功能研究

郭葉青，曾凡軍，趙必君，周媛媛，丁文柏，阮玉姝，熊曉琦,孟麗霞

(湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院&三峽大學第一臨床醫(yī)學院，湖北 宜昌　443003)

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miR-126抑制結腸癌增殖及侵襲轉移的功能研究

郭葉青，曾凡軍，趙必君，周媛媛，丁文柏，阮玉姝，熊曉琦,孟麗霞

(湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院&三峽大學第一臨床醫(yī)學院，湖北 宜昌443003)

摘要：目的研究miR-126在體內是否具有抑制結腸癌細胞增殖及侵襲轉移的功能。方法利用慢病毒載體構建穩(wěn)定過表達miR-126的結腸癌細胞系HCT116，將實驗組及對照組細胞分別進行裸鼠皮下及尾靜脈成瘤體內實驗。結果成功構建穩(wěn)定過表達miR-126細胞系HCT116；裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示過表達miR-126實驗組皮下移植瘤瘤體平均體積明顯小于其對照組瘤體體積(P<0.05)；尾靜脈成瘤組中穩(wěn)定過表達miR-126實驗組肺部轉移灶的平均數(shù)目、面積均明顯小于其對照組(P<0.05)。結論裸鼠移植瘤實驗證實miR-126在體內具有抑制結腸癌細胞增殖及侵襲轉移的作用。

關鍵詞：miR-126；結腸癌；慢病毒；增殖；侵襲轉移

結腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內每年大約新發(fā)100萬結腸癌患者，并且有50余萬患者因之而死亡。早期結腸癌病人通過手術治療預后較好，但是晚期病人的5年生存率僅有20%左右，治療效果不佳，其死亡的主要原因是腫瘤的轉移[1]。結腸癌的轉移機制非常復雜，這一過程涉及癌細胞的上皮—間質轉換、侵襲黏附能力、血管生成、胞外基質降解以及微環(huán)境趨化作用[2-3]。microRNA(miRNA)是長度約為19~24個核苷酸的一類內源性小分子非編碼RNA，參與了基因轉錄后水平的調控。其作用機制是通過與靶mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’untranslational region，3’UTR)完全或不完全的互補結合，使靶mRNA直接發(fā)生降解或者抑制其翻譯，從而負調控靶基因的表達[4]。

已有大量研究證實miR-126是腫瘤增殖及轉移抑制基因[5-6]，為了研究miR-126在體內是否具有抑制結腸癌增殖、侵襲轉移的作用，本研究利用慢病毒載體構建穩(wěn)定過表達miR-126的結腸癌細胞系HCT116，進行裸鼠皮下、尾靜脈成瘤等體內實驗，研究miR-126在體內是否能抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲轉移。

1材料和方法

1.1材料慢病毒過表達載體pGIPZ、慢病毒膜蛋白表達質粒pLTR-G、慢病毒包裝質粒pCD/NL-BH，均購買于Addgene公司；限制性內切酶、T4DNA連接酶、質粒抽提試劑盒購自Invitrogen公司；U6 and hsa-mir-126 snRNA Realtime PCR試劑盒購自上海吉瑪公司；基因合成及測序由上海生工生物公司完成；人結腸癌HCT116細胞系購自中科院上海細胞庫；實驗用裸鼠購自長沙斯萊克斯公司，為4周齡雄性裸鼠，SPF級，許可證號：SCXK(湘)2013-0004。

1.2方法

1.2.1穩(wěn)定過表達miR-126結腸癌細胞系HCT116的構建自miRBase中找到hsa-miR-126序列，在Primer 引物設計軟件中將該段序列向上游、下游延伸大約100 bp設計PCR引物，并于末端引入保護堿基、Xho I 、BamH I酶切位點，序列如下：Hsa-miR-126-Xho I-F：CAACAGAAGGCTCGAGGGCAGGTTGCCCGGAGC;Hsa-miR-126-BamH I-R： ATTCTGATCAGGATCCCGCCTAAGTACGTCGGGGC。

以人的正常gNDA為模板， hsa-miR-126-BamH Ι-R、hsa-miR-126-Xho Ι-F為引物，擴增has-miR-126的前體pre-miR-126序列，膠回收PCR產(chǎn)物。用BamH I、Xho I對過表達載體pGIPZ進行酶切，將pre-miR-126序列連接入過表達載體pGIPZ，轉化Dh5a感受態(tài)，挑取克隆進行菌落的PCR鑒定，接種陽性的克隆。華大基因公司測序結果證實插入的序列為pre-miR-126序列，接種并抽提質粒。抽提質粒后利用293T細胞進行慢病毒的包裝，收集病毒液進行濃縮、滴度測定。然后將包裝好的穩(wěn)定過表達miR-126實驗組及對照組慢病毒感染HCT116細胞，流式細胞儀篩選純化GFP陽性的被感染結腸癌細胞，即得到穩(wěn)定過表達miR-126實驗組及對照組結腸癌細胞系HCT116。抽提過表達miR-126實驗組及對照組結腸癌細胞總RNA，行RNA質檢后進行U6及miR-126的逆轉錄，然后進行RT-PCR檢測過表達實驗組及對照組結腸癌細胞系中miR-126的表達，實驗重復三次。

(1)逆轉錄反應:①逆轉錄體系：RT-Primer 1 μL，Template RNA 4 μg，dNTPs 1 μL，RNase-free water up to 12 μL，65℃ 5 min，立即置于冰上；RNase Inhibitor 1 μL，DTT 2 μL，5×buffer 4 μL，37℃ 2 min，MMLV 1 μL；②逆轉錄程序：37℃ 50 min， 70℃ 15 min。

(2) RT-PCR:①反應體系：10×miScript Primer 0.4 μL，2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，RNase-free water 7.4 μL，Taq DNA Polymerase 0.2 μL；②realtime PCR程序：95℃ 3 min，95℃12 s，62℃ 50 s，后兩步為40個循環(huán)。

1.2.2裸鼠皮下成瘤實驗(1) 4周齡雄性裸鼠12 只，隨機分成兩組，培養(yǎng)穩(wěn)定過表達miR-126細胞株HCT116和對照組細胞株，按照每只裸鼠5×106個細胞，每只裸鼠注射0.2 mL細胞懸液于裸鼠右側腋下皮下;(2)計算腫瘤體積(V)，V=L×W2×0.52，計算兩組皮下移植瘤大小并統(tǒng)計分析。

1.2.3裸鼠尾靜脈成瘤實驗(1)將12只4周齡雄性裸鼠隨機分成兩組， miR-126穩(wěn)定過表達細胞系HCT116實驗組及對照組；(2)培養(yǎng)穩(wěn)定過表達miR-126細胞株HCT116和對照細胞株，按照每只裸鼠1×106個細胞，用1 mL注射器每只注射0.2 mL 細胞懸液于裸鼠尾靜脈；(3)注射后密切觀察裸鼠的生長情況， 50 d后處死所有裸鼠，取其肺臟、肝臟、脾臟石蠟包埋，再切片行HE染色，若發(fā)現(xiàn)轉移灶，則計數(shù)腫瘤轉移灶的數(shù)目，并計算腫瘤轉移灶的面積，然后對兩組裸鼠的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結果

2.1穩(wěn)定過表達miR-126結腸癌細胞系HCT116的構建

2.1.1穩(wěn)定過表達miR-126質粒的構建(1) PCR擴增miR-126前體序列：PCR擴增得到大小為319 bp的產(chǎn)物(圖1)。

注：1.PCR產(chǎn)物；2.DNA marker。

(2)過表達載體pGIPZ的線性化：回收miR-126前體，然后用BamH I、Xho I酶對過表達載體pGIPZ行雙酶切，酶切后進行電泳，回收大小約11 kb產(chǎn)物(圖2)。

(3)菌落的PCR鑒定 陽性克隆可以得到大小為715 bp的條帶，陰性克隆則得到434 bp條帶(圖3)。

(4)陽性克隆的測序：接種陽性轉化子后，取100 μL菌液測序，測序結果示過表達載體pGIPZ中插入的目的序列與miR-126的前體序列一致(圖4)。

2.1.2慢病毒包裝將過表達載體pGIPZ-miR-126(對照組為pGIPZ空質粒)、膜蛋白表達質粒pLTR-G、慢病毒包裝質粒pCD/NL-BH共轉染293T細胞，于48 h后觀察熒光表達，293T細胞中綠色熒光表達明顯，證實慢病毒的包裝成功。

注：1.DNA marker；2.pGIPZ酶切產(chǎn)物。

注：1.DNA Marker；2~9.挑取的8個轉化子；10.空載體；11.H2O。

2.1.3穩(wěn)定過表達miR-126慢病毒感染HCT116后的熒光表達將過表達miR-126慢病毒pGIPZ-miR-126及pGIPZ空質粒的對照病毒液按MOI=50加入HCT116細胞培基中，培養(yǎng)48～72 h后于熒光顯微鏡下觀察，可見HCT116細胞中有綠色熒光，證明慢病毒感染HCT116細胞成功，下文中用HCT116+pGIPZ-miR-126表示轉染了過表達miR-126質粒pGIPZ-miR-126的HCT116細胞，用HCT116+pGIPZ表示轉染了pGIPZ對照質粒的HCT116細胞。將流式細胞儀分選后的HCT116+pGIPZ-miR-126、HCT116+pGIPZ擴大培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光表達(圖5)。

注：A、C無熒光，B、D有熒光。

2.1.4Realtime PCR檢測miR-126過表達實驗組及對照組中的表達Realtime PCR的結果顯示：在過表達實驗組中miR-126的表達為對照組的5.08倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，證明穩(wěn)定過表達miR-126的結腸癌HCT116細胞系構建成功。

2.1.5裸鼠皮下成瘤實驗結果圖6分別為miR-126過表達實驗組及對照組裸鼠，利用公式V=L×W2×0.52計算皮下移植瘤瘤體體積(V)，對兩組裸鼠皮下移植瘤的體積進行統(tǒng)計，miR-126過表達實驗組(HCT116+pGIPZ-miR-126)裸鼠皮下腫瘤平均體積為(743.81±70.15)mm3，miR-126過表達對照組(HCT116+pGIPZ)裸鼠皮下移植瘤平均體積為(1 413.10±150.16)mm3，對兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義(圖7)。

A.過表達實驗組B.過表達對照組

圖6HCT116+pGIPZ-miR-126及

HCT116+pGIPZ皮下成瘤組裸鼠

2.1.6裸鼠尾靜脈成瘤實驗結果將顯微鏡下觀察到的轉移腫瘤癌的數(shù)目及面積進行統(tǒng)計，結果顯示miR-126過表達實驗組的平均轉移灶的數(shù)目為4個，其對照組的平均腫瘤轉移灶數(shù)目為9個，P<0.05；過表達miR-126實驗組腫瘤轉移灶的平均面積為(0.26±0.03)mm2，其對照組的腫瘤轉移灶平均面積為(0.51±0.04)mm2，P<0.05(圖8)。

AB

圖8HCT116+pGIPZ-miR-126及HCT116+pGIPZ

尾靜脈組裸鼠肺HE染色(40×)

注：A.過表達實驗組；B.過表達對照組;實驗組與對照組轉移灶數(shù)目及面積比較，P<0.05。

3討論

MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為19～25個核苷酸的內源性小分子非編碼RNA，它通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)完全或不完全互補在轉錄后的水平調控基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，人類miRNA基因有一半以上定位于腫瘤相關基因區(qū)域或脆性位點，這個區(qū)域時常發(fā)生染色體片段的易位、異常擴增、缺失[7]。目前已有大量研究證實miRNA的異常表達與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，其中包括miR-17、miR-19a、miR-21、miR-34a、miR-143和miR-145等[8-10]。本實驗利用慢病毒載體構建穩(wěn)定過表達miR-126的結腸癌細胞系HCT116+pGIPZ-miR-126及對照組細胞HCT116+pGIPZ，進行裸鼠皮下、尾靜脈成瘤等體內實驗，研究miR-126在體內是否能抑制結腸癌細胞的增殖及侵襲轉移。

慢病毒(lentivirus)是一種RNA病毒，因其病毒粒子中含有逆轉錄酶，故又稱逆轉錄病毒。慢病毒顆粒進入宿主細胞后能以自身RNA為模板在逆轉錄酶的催化下生成互補DNA，然后以此互補DNA為模板來合成雙鏈的DNA，雙鏈DNA經(jīng)環(huán)化后在病毒整合酶的作用下可整合到宿主細胞的染色體上長期地表達[11]。本實驗用穩(wěn)定過表達miR-126慢病毒pGIPZ-miR-126及對照組慢病毒pGIPZ空質粒感染結腸癌HCT116細胞系，感染后通過流式細胞儀篩選純化被感染細胞(GFP陽性細胞)，純化后擴大培養(yǎng)并使用RT-PCR技術檢測各組細胞中miR-126的表達，結果顯示在HCT116 +pGIPZ-miR-126組中miR-126的表達為HCT116+pGIPZ組的5.08倍，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，證明穩(wěn)定過表達miR-126的結腸癌HCT116細胞系構建成功。

目前的結腸癌動物模型可分為誘發(fā)性、自發(fā)性、轉基因性及移植性動物腫瘤模型。其中移植瘤模型的成功率高、建立周期較短、生物學性狀穩(wěn)定，能滿足腫瘤的生物學研究而被廣泛應用。已有大量研究報道m(xù)iR-126在肺癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌的作用。Zhu等[12]研究報道，非小細胞肺癌細胞系A549中過表達miR-126后，可通過抑制VEGFA基因的表達而發(fā)揮抑制肺癌細胞的增殖。Yu等[13]實驗證實miR-126可抑制卵巢癌細胞的增殖。本研究使用穩(wěn)定過表達miR-126和其對照組結腸癌細胞HCT116注射于4周齡裸鼠右側腋下，比較各組皮下移植瘤的體積的大小，結果顯示過表達miR-126實驗組裸鼠皮下移植瘤體積明顯小于其對照組皮下移植瘤體積，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明miR-126具有抑制結腸癌細胞在體內的增殖作用。

另已有多項研究證實miR-126與腫瘤的侵襲轉移有關。Sasahira等[14]證實miR-126可通過負調控VEGF基因的表達而抑制口腔癌細胞的遷移、侵襲，發(fā)揮著抑癌基因的作用。Frampton等[15]報道m(xù)iR-126可通過抑制其靶基因ADAM9的表達而抑制胰腺癌細胞的侵襲轉移。本研究通過構建穩(wěn)定過表達miR-126的結腸癌細胞系進行裸鼠尾靜脈成瘤實驗，結果顯示miR-126過表達實驗組及對照組裸鼠的肺臟均發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移灶，且統(tǒng)計結果顯示miR-126過表達實驗組肺臟內的轉移灶的數(shù)目和面積均低于其對照組(P<0.05)，證實了miR-126可明顯抑制結腸癌細胞的侵襲轉移。

綜上所述，本研究通過動物實驗證實了miR-126在體內具有抑制結腸癌細胞增殖及侵襲轉移的作用，有可能成為有潛力的結腸癌診治新靶點。

參考文獻：

[1]Siegel R,Desantis C,Jemal A.Colorectal cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(2):104-117.

[2]Wu ZH,Wang XL,Tang HM,et al.Long non-coding RNA HOTAIR is a powerful predictor of metastasis and poor prognosis and is associated with epithelial-mesenchymal transition in colon cancer[J].Oncol Rep,2014,32(1):395-402.

[3]Gou HF,Huang J,Shi HS,et al.Chemo-immunotherapy with oxaliplatin and interleukin-7 inhibits colon cancer metastasis in mice[J].PLoS One,2014,9(1):e85789.

[4]Su Y,Li X,Ji W,et al.Small molecule with big role:MicroRNAs in cancer metastatic microenvironments[J].Cancer Lett,2014,344(2):147-156.

[5]Jusufovic E,Rijavec M,Keser D,et al.let-7b and miR-126 are down-regulated in tumor tissue and correlate with microvessel density and survival outcomes in non-small-cell lung cancer[J].PLoS One,2012,7(9):e45577.

[6]Hamada S,Satoh K,Fujibuchi W,et al.MiR-126 acts as a tumor suppressor in pancreatic cancer cells via the regulation of ADAM9[J].Mol Cancer Res,2012,10(1):3-10.

[7]Zhang QH,Sun HM,Zheng RZ,et al.Meta-analysis of microRNA-183 family expression in human cancer studies comparing cancer tissues with noncancerous tissues[J].Gene,2013,527(1):26-32.

[8]Bauer KM,Hummon AB.Effects of the miR-143/-145 microRNA cluster on the colon cancer proteome and transcriptome[J].J Proteome Res,2012,11(9):4744-4754.

[9]Zhang J,Xiao Z,Lai D,et al.miR-21,miR-17 and miR-19a induced by phosphatase of regenerating liver-3 promote the proliferation and metastasis of colon cancer[J].Br J Cancer,2012,107(2):352-359.

[10] Bu P,Chen KY,Chen JH,et al.A microRNA miR-34a-regulated bimodal switch targets Notch in colon cancer stem cells[J].Cell Stem Cell,2013,12(5):602-615.

[11] Alimperti S,Lei P,Tian J,et al.A novel lentivirus for quantitative assessment of gene knockdown in stem cell differentiation[J].Gene Ther,2012,19(12):1123-1132.

[12] Zhu X,Li H,Long L,et al.miR-126 enhances the sensitivity of non-small cell lung cancer cells to anticancer agents by targeting vascular endothelial growth factor A[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2012,44(6):519-526.

[13] Yu Q,Liu SL,Wang H,et al.miR-126 Suppresses the proliferation of cervical cancer cells and alters cell sensitivity to the chemotherapeutic drug bleomycin[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(11):6569-6572.

[14] Sasahira T,Kurihara M,Bhawal UK,et al.Downregulation of miR-126 induces angiogenesis and lymphangiogenesis by activation of VEGF-A in oral cancer[J].Br J Cancer,2012,107(4):700-706.

[15] Frampton AE,Krell J,Jacob J,et al.Loss of miR-126 is crucial to pancreatic cancer progression[J].Expert Rev Anticancer Ther,2012,12(7):881-884.

Suppression of proliferation and metastasis of colon cancer by miR-126

GUO Ye-qing，ZENG Fan-jun,ZHAO Bi-jun,et al

(YichangCentralHospital&TheFirstClinicalMedicalFacultyof

ThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443003,China)

Abstract:ObjectiveTo study the function of miR-126 in suppression of proliferation and metastasis of colon cancer in vivo.MethodsWe constructed stable overexpression of miR-126 colon cancer cell line HCT116 with lentiviral vector,and executed subcutaneous tumor formation and tail vein tumor formation test in nude mice with stable overexpression miR-126 colon cancer cell lines.ResultsStable overexpression of miR-126 cell line HCT116 was successfully constructed.Nude mice tumor formation experiment results showed that the mean tumor volume of overexpression of miR-126 in experimental group was significantly less than the tumor volume in control group(P<0.05).Tail vein tumor formation experiment results showed that the average number and size of lung metastases of overexpression of miR-126 in experimental group was significantly less than those in control group.ConclusionsNude mice tumor formation experiment results confirm that miR-126 can inhibit colon cancer cell＇s proliferation and metastasis in vivo.

Key words:miR-126;colon cancer;lentiviral vector;proliferation;metastasis

(收稿日期：2014-07-15，修回日期：2014-09-25)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.03.009