食用植物油中生育酚含量測定方法優(yōu)化及分析

李 柰，樊 琛，李小波，龍立梅，曹學(xué)麗

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

食用植物油中生育酚含量測定方法優(yōu)化及分析

李 柰，樊 琛，李小波，龍立梅，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

采用高效液相色譜法測定了8種24個植物油樣本中生育酚的含量，并對生育酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。在室溫下，以甲醇為溶劑，采用超聲法進(jìn)行提取，料液比為1∶1.25，提取3次，每次20 min，采用液相色譜方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明：該方法在生育酚質(zhì)量濃度為0.05～1.00 g/L時，相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)到0.999 2～0.999 4，線性關(guān)系良好；檢出限分別為α-生育酚0.5 mg/L，γ-生育酚2.0 mg/L，δ-生育酚1.2 mg/L；三水平加標(biāo)樣品的平均回收率為92.1%～99.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為2.5%～8.5%。在8種植物油中，葵花籽油中α-生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可達(dá)4.2349×10-4，大豆油的β/γ-生育酚、δ-生育酚及總生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為7.371 3×10-4，1.621 5×10-4，9.883 6×10-4。

食用植物油；生育酚；高效液相色譜法

生育酚（tocopherol）即維生素E，是一種脂溶性維生素，外觀呈無色至淺黃色，幾乎無嗅，氧化后顏色逐漸變深至棕紅色［1］。天然生育酚包含4種右旋光學(xué)異構(gòu)體［2］，根據(jù)其苯環(huán)上所含甲基位置和數(shù)目的不同，將它們分別命名為α，β，γ和δ-生育酚。每種生育酚異構(gòu)體的生物活性強(qiáng)弱不同，其中以α-生育酚的生物活性最高［3］，δ-生育酚的抗氧化能力最強(qiáng)［4］。生育酚具有抗不育［5-6］、抗衰老［7-8］、抗氧化［9-11］、免疫調(diào)節(jié)［12-14］、胰島細(xì)胞保護(hù)［15-16］等諸多功能，因而被人們廣泛研究。植物油是人們?nèi)粘Ｉ钪蝎@取生育酚的主要來源之一，不同品種的植物油中生育酚的含量有較大差異［17］，因此生育酚的組成和含量可以作為食用植物油脂品質(zhì)的一個重要評價指標(biāo)［18］。

目前，生育酚的分析方法包括高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、紙層析法、柱層析法、比色法等［19-22］，最常用的是高效液相色譜法，我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)［23-24］、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［25］均采用此法。這些標(biāo)準(zhǔn)在液相色譜分析前均采用了皂化方法進(jìn)行提取，該方法時間長而且步驟復(fù)雜。為尋找更加簡單易行的提取方法，本實(shí)驗(yàn)擬采用超聲法對生育酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用高效液相色譜法測定北京居民經(jīng)常食用的8個種類24個植物油樣本中生育酚的含量，為居民選用富含生育酚的植物油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物油樣品分別從北京各大超市購買，共8個種類24個品牌，包括橄欖油（壓榨，一級）、玉米油（壓榨，一級）、花生油（壓榨，一級）、葵花籽油（壓榨，一級）、調(diào)和油、大豆油（浸出，一級）、芝麻油（壓榨，一級）、亞麻籽油（壓榨，一級），每個種類選取1～5個不同品牌；生育酚標(biāo)準(zhǔn)品：α-生育酚（色譜級，純度99.8%）、β-生育酚（色譜級，純度99.5%）、γ-生育酚（色譜級，純度99.0%）、δ-生育酚（色譜級，純度98.3%），Sigma公司；無水甲醇（分析純），北京化工廠；甲醇（色譜純），F(xiàn)isher Scientific；純水由Millipore-Q純水機(jī)自制。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；GR-200型電子分析天平，北京儀誠科技公司；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；1260型高效液相色譜系統(tǒng)（配自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器DAD和色譜工作站等），美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件的選擇

安捷倫ZORBAX SB-C18型色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，流動相甲醇與水的體積比為98∶2，等度洗脫15 min，流速1.0 mL/min，DAD檢測波長295 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別用甲醇溶解定容到10.0 mL棕色容量瓶中，各標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度為1.00 g/L，并放置冰箱保存。使用前調(diào)至不同質(zhì)量濃度，并用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確質(zhì)量濃度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的標(biāo)定

分別取生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液100.0 μL，用無水甲醇分別稀釋定量至10.0 mL容量瓶中，在295 nm波長下測定各生育酚的吸光值，用比吸光系數(shù)計算各生育酚的質(zhì)量濃度。

計算公式見式（1）。

式（1）中，C1為生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，g/L；A為生育酚的平均紫外吸光值；E為生育酚1%比吸光系數(shù)（α、γ、δ-生育酚的E值分別以73，92，93帶入）；V2為標(biāo)準(zhǔn)測定溶液體積（10.0 mL）；V1為標(biāo)準(zhǔn)溶液取用量，mL。

1.3.4 提取條件的選擇

以某品牌大豆油為原料，在室溫情況下，采用超聲波法進(jìn)行提取，將甲醇作為提取溶劑，分別考慮提取次數(shù)、料液比以及提取時間3個條件對提取效果的影響。

1）提取次數(shù)的確定。取1.0 g大豆油，加入10.0 mL甲醇，超聲提取20 min后將上清液倒出并再次加入等體積甲醇，超聲相同時間，以此類推，共提取5次。

2）料液比的確定。將大豆油與甲醇按不同提取比例1∶10，1∶5，1∶1.67，1∶1.25，1∶1，1∶0.5（g/mL）進(jìn)行提取，（樣品質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.6，0.8，1.0，2.0 g/mL），共提取5次，每次超聲20 min。

3）提取時間的確定。取1.0 g大豆油，加入10.0 mL甲醇，超聲提取時間分別為10，20，30，40，50 min，共提取5次，每次均將上清液倒出并加入等體積甲醇進(jìn)行再次提取。

將每次提取出的上清液濃縮至干，加1.0 mL甲醇溶解過膜，用HPLC方法進(jìn)行檢測。

1.3.5 加標(biāo)回收率與精密度

為了考察整個方法的可靠性，分別對植物油中大豆油、調(diào)和油、玉米油的1號品牌進(jìn)行混合生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別加入50，100，150 μL質(zhì)量濃度為0.10 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，每個水平重復(fù)3次，然后按照1.3.1的方法進(jìn)行測定。

1.3.6 不同種類植物油中生育酚含量測定

選用市售8個不同種類、不同品牌的植物油作為樣品，按照優(yōu)化的方法進(jìn)行超聲提取，并進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 生育酚標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of tocopherol standards

2.1 工作曲線與檢出限分析

生育酚異構(gòu)體共4種物質(zhì)，但用普通C18反相色譜柱分析時，β-生育酚與γ-生育酚會在同一時間出峰，無法分開。α-生育酚、β/γ-生育酚、δ-生育酚的液相色譜如圖1。在選定的色譜條件下，測定α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)信噪比（S/N=3）計算各組分的檢出限，結(jié)果如表1。生育酚異構(gòu)體在質(zhì)量濃度為0.05～1.00 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.1 Appearance time，standard curves，correlation coefficients（R2）and limits of detection of tocopherols

2.2 提取條件優(yōu)化

大豆油提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。由圖2可知，料液比對提取結(jié)果的影響最大，開始時隨著大豆油加入量的增多，提取到的生育酚含量也越來越多，但是當(dāng)提取比例大于1∶1.25（g/mL）時，提取到的生育酚的含量有所降低，這主要是由于植物油加入量過多時，甲醇不能將其完全提取，脂溶性的生育酚在植物油中有殘留［26］，所以最適的提取比例為1∶1.25（g/mL，即質(zhì)量濃度為0.8 g/mL）。在提取次數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，提取3次基本上可以將生育酚提取完全，所以最適的提取次數(shù)為3次。提取時間對提取結(jié)果的影響最小，而且隨著超聲時間的增加，生育酚含量有輕微降低，這可能是超聲過程中溫度升高，生育酚緩慢分解導(dǎo)致，考慮生育酚提取完全以及經(jīng)濟(jì)性原則，選擇較佳的提取時間為20 min。

圖2 大豆油提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Single factor experiments of soybean oil extraction

2.3 方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性分析

植物油中大豆油、調(diào)和油、玉米油1號品牌的混合生育酚標(biāo)準(zhǔn)品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，加標(biāo)樣品的平均回收率為92.1%～99.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為2.5%～8.5%，說明此方法對生育酚的測定具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 生育酚的加標(biāo)回收率及RSD值Tab.2 Spiked recovery and RSD of tocopherols%

2.4 植物油中生育酚檢測結(jié)果

選取8種植物油共24個樣品按照優(yōu)化條件進(jìn)行超聲提取，然后運(yùn)用HPLC方法進(jìn)行分析，檢測結(jié)果如圖3。通過圖3可明顯看出，在8種植物油中大豆油中β/γ-生育酚及δ-生育酚的含量最高，葵花籽油中α-生育酚的含量最高。

圖3 不同植物油液相分析色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of different edible vegetable oils

生育酚含量的具體計算結(jié)果如圖4。由圖4可知，活性最強(qiáng)的α-生育酚在葵花籽油（12～14號）中的含量較高，12號葵花籽油樣品中α-生育酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到4.234 9×10-4。β/γ-生育酚和δ-生育酚在玉米油（4～6號）、調(diào)和油（15～17號）、大豆油（18～20號）、芝麻油（21～23號）中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其中大豆油的含量最為豐富，在19號大豆油樣品中β/γ-生育酚、δ-生育酚及總生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可分別高達(dá)7.371 3×10-4，1.621 5×10-4，9.883 6 ×10-4。從總生育酚含量上分析，8種植物油生育酚含量由高到低順序基本為：大豆油、調(diào)和油、玉米油、葵花籽油、芝麻油、亞麻籽油、花生油、橄欖油。

3 結(jié)論

圖4 不同植物油樣品生育酚含量分析Fig.4 Column chart analysis of tocopherols content in different edible vegetable oils

本實(shí)驗(yàn)采用超聲法優(yōu)化了植物油中生育酚異構(gòu)體的提取條件，并采用高效液相色譜法測定了8種植物油中24個樣品的含量。最適宜的超聲提取方法為：在室溫條件下，以甲醇為提取溶劑，料液比例為1∶1.25，超聲提取3次，每次20 min。該方法在生育酚質(zhì)量濃度為0.05～1.00 g/L時，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.999 2～0.999 4，線性關(guān)系良好；液相測定生育酚的檢出限分別為：α-生育酚0.5 mg/L，γ-生育酚2.0 mg/L，δ-生育酚1.2 mg/L；三水平加標(biāo)樣品的平均回收率為92.1%～99.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為2.5%～8.5%，說明此方法對生育酚的測定具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。8種類型的植物油中，大豆油所含的β/γ-生育酚和δ-生育酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都很高，最高值可分別達(dá)到7.371 3×10-4和1.621 5×10-4，總生育酚為9.883 6×10-4?；钚宰顝?qiáng)的α-生育酚在葵花籽油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可達(dá)到4.234 9×10-4，從總生育酚含量上分析，8種植物油生育酚含量由高到低順序?yàn)椋捍蠖褂?、調(diào)和油、玉米油、葵花籽油、芝麻油、亞麻籽油、花生油、橄欖油。本實(shí)驗(yàn)與國標(biāo)中采用的皂化提取方法相比，操作更加簡單易行，且大大縮短了前處理時間，可為植物油中生育酚的提取及檢測提供參考。

［1］王義永.高純度天然維生素E工業(yè)化生產(chǎn)工藝路線的開發(fā)與實(shí)現(xiàn)［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2013.

［2］李海洋.高含量天然α-生育酚的制備研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2013.

［3］胡傳榮，趙昕，章啟勇.高活性α-生育酚的制備［J］.食品與機(jī)械，2005（4）：10-14.

［4］兼松弘，吳艷霞.生育酚異構(gòu)體的抗氧化力和基質(zhì)的關(guān)系［J］.油脂科技，1985（6）：49-53.

［5］韓文祥.簡述維生素E的功能及其缺乏癥［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（16）：110-111.

［6］郎楠，張樹成，賀斌，等.維生素E在妊娠過程中的作用［J］.中國計劃生育學(xué)雜志，2013（5）：352-354.

［7］李響，梁杰.枸杞多糖與維生素E延緩小鼠皮膚衰老的實(shí)驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009（13）：1465-1466.

［8］張石革.維生素E與抗衰老［J］.中國藥房，2005（23）：1839-1840.

［9］Niki E，Noguchi N.Dynamics of antioxidant action of vitaminE.［J］.Acc Chem Res，2004，37（1）：45-51.

［10］朱雪梅，吳俊鋒，胡蔣寧，等.α-生育酚在花生油、芝麻油和菜籽油中的抗氧化效能［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013（10）：85-90.

［11］王豐玲，張英鋒，鄭向美，等.天然維生素E的制備、抗氧化機(jī)理及應(yīng)用前景［J］.化學(xué)教育，2007（12）：10-12.

［12］王傳蓉，王加啟，周振峰，等.維生素E的免疫研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008（8）：24-28.

［13］柴海靜.維生素E的免疫功能研究［J］.當(dāng)代畜牧，2013（11）：23-24.

［14］王凡.維生素E和免疫［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2012（5）：117.

［15］袁英，張艷，宋仕卿，等.α-生育酚緩解鏈脲佐菌素誘導(dǎo)乳鼠胰島細(xì)胞損傷的研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011（7）：676-677.

［16］郭兵，秦觀海，袁英.α-生育酚對鏈脲菌素誘導(dǎo)乳鼠胰島細(xì)胞凋亡的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010（16）：2190-2191.

［17］黃百芬，譚瑩，姚建花，等.浙江省居民常用食用植物油中4種生育酚異構(gòu)體的含量分析［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2013（1）：78-82.

［18］Zuta P C，Simpson B K，Zhao X，et al.The effect of αtocopherol on the oxidation of mackerel oil［J］.Food Chemistry，2007，100（2）：800-807.

［19］Bele C，Matea C T，Raducu C，et al.Tocopherol content in vegetable oils using a rapid HPLC fluorescence detection method［J］.Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca，2013，41（1）：93-96.

［20］Nagao T，Kobayashi T，Hirota Y，et al.Improvement of aprocess for purification of tocopherols and sterols from soybean oil deodorizer distillate［J］.Molecular Catalysis B：Enzymatic，2005，37（1-6）：56-62.

［21］Cheman Y B，Ammawath W，Mirghani M E S.Determining α-tocopherol in refined bleached and deodorized palm olein by Fourier transform infrared spectroscopy ［J］.Food Chemistry，2005，90（1-2）：323-327.

［22］Kadioglu Y，Demirkaya F，Demirkaya A K.Quantitative determination of underivatized α-tocopherol in cow milk，vitamin and multivitamin drugs by GC-FID［J］. Chromatographia，2009，70（3-4）：665-670.

［23］孟橘，倪芳妍，夏天文，等.GB/T 26635—2011動植物油脂生育酚及生育三烯酚含量測定高效液相色譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［24］王光亞，李晶.GB/T 5009.82—2003食品中維生素A和維生素E的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［25］謝立華，李培武，丁小霞，等.NY/T 1598—2008食用油中維生素E組分和含量的測定高效液相色譜法［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［26］于瑞祥，張欣，張秀芹，等.反相高效液相色譜法同時測定植物油中四種生育酚［J］.分析測試學(xué)報，2013（6）：764-767.

Optimization of Determination Method and Analysis on Tocopherol Content in Edible Vegetable Oils

LI Nai，F(xiàn)AN Chen，LI Xiaobo，LONG Limei，CAO Xueli*
（School of Food and Chemical Engineering/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

The tocopherol contents in 8 kinds of edible vegetable oils（total 24 samples）were determined by HPLC and the extraction conditions were optimized.Tocopherol was extracted three times by the ultrasonic method and the extraction conditions were liquid material ratio 1∶1.25 and extraction time 20 min. The results showed that the correlation coefficient R2was 0.999 2-0.999 4 within the scope of 0.05-1.00 g/L.The detection limits of α-tocopherol，γ-tocopherol，and δ-tocopherol were 0.5，2.0，1.2 mg/L，respectively，and the recovery average was 92.1%-99.8%.Meanwhile，the relative standard deviation（RSD，n=3）was between 2.5%-8.5%.Sunflower seed oil had the highest α-tocopherol content（4.234 9×10-4）while soybean oil had the highest β/γ-tocopherol（7.371 3×10-4），δ-tocopherol（1.621 5×10-4），and total tocopherols（9.883 6×10-4）contents.

edible vegetable oils；tocopherols；HPLC

葉紅波）

TS227

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.03.011

2095-6002（2015）03-0059-05

李柰，樊琛，李小波，等.食用植物油中生育酚含量測定方法優(yōu)化及分析［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2015，33（3）：59-63.

LI Nai，F(xiàn)AN Chen，LI Xiaobo，et al.Optimization of determination method and analysis on tocopherol content in edible vegetable oils［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（3）：59-63.

2014-07-09

北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（KZ201410011016）。

李 柰，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程；

*曹學(xué)麗，女，教授，博士，主要從事生物分離技術(shù)方面的研究。

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