油茶不同芽苗砧嫁接組合的親和性生理1)

楊邵 束慶龍 姚小華 龍偉 王開良 任華東 滕建華

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥，230036) (中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所) (浙江省金華市婺城區(qū)東方紅林場)

責(zé)任編輯:程 紅。

油茶(Camellia oleifera)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠灌木或小喬木，是我國南方重要的經(jīng)濟林木［1］。當(dāng)前，芽苗砧嫁接是油茶良種繁育的主要途徑，而嫁接親和性是影響嫁接成活率的關(guān)鍵因素。油茶嫁接親和性受到遺傳、解剖結(jié)構(gòu)、生長特性、生理生化、環(huán)境條件等多種因素的影響，是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，因此，嫁接親和性的機理研究一直未能得到明晰的回答，是嫁接領(lǐng)域研究的難點［2］。陳紅等［3］研究探索了茄子/番茄嫁接體嫁接愈合過程砧木和接穗的生理生化相互作用對嫁接親和性的影響，也有研究對黃瓜等［4－7］嫁接體SOD活性、CAT活性、POD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與嫁接親和性進行了研究。但至目前為止，有關(guān)油茶嫁接愈合過程中生理生化的變化規(guī)律尚未見報道。本研究對油茶不同品種接穗嫁接愈合過程中結(jié)合部的生理指標(biāo)及死亡率的動態(tài)變化進行研究，以期揭示不同油茶品種嫁接組合的親和性及其機理，為更好地選擇品種組合、提高芽苗砧嫁接成活率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

供試種子于2013年10月采自浙江省金華市婺城區(qū)東方紅林場，穗條分別來自于同一品種植株上部的半木質(zhì)化的當(dāng)年生枝條。取普通油茶長林系列4#、18#品種穗條為接穗，以普通油茶長林系列18#品種芽苗作為砧木，嫁接后嫁接體組合分別為4/18、18/18。種子沙藏催芽后待生長為健壯的芽苗，從胚芽近基部2 cm處切除胚芽，并將主根頂端切除保留6 cm左右作為砧木。穗條長度為3 cm，保留有一個葉片和一個葉芽，栽種于苗床上，苗床上方用農(nóng)膜搭起50 cm高的小拱棚保濕，栽種45 d后揭膜。

1．2 方法

試驗設(shè)計:每種嫁接組合各嫁接450株，于5月29日嫁接中取樣1次，嫁接移栽后前6 h，每2 h取樣1次，共3次;第6小時至第16小時，每5 h取樣1次，共2次;第16小時至第24小時，8 h取樣1次;第3天至第9天，每2 d取樣1次，共4次;第15天至第55天，每10 d取樣1次，共5次;總共16次。采用完全隨機的方法取樣，每次取樣15株，重復(fù)3次，截取嫁接結(jié)合部1．0～1．5 cm的部分在流水中清洗干凈，裝入自封袋中。

死亡率的測定:每次取樣前先清除接穗枯萎的嫁接體，并計數(shù)為ni，油茶芽苗砧嫁接體的動態(tài)死亡率pi=(ni/(N－∑ni－1－∑Ai－1))×100%。式中:N為總的嫁接體株數(shù);A為每次取樣的嫁接體株數(shù);i為取樣次數(shù)。

理化指標(biāo)測定:稱取樣品鮮質(zhì)量0．2 g于預(yù)冷的研缽中，加入10 mL預(yù)冷的pH=7．8磷酸緩沖液，用液氮研磨提取，然后將提取液于4℃，105 000 r·min－1離心15 min，取上清液為酶液，放入冰箱中4℃保存?zhèn)溆?。氧化物歧化?SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法［8］測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用H2O2法［9］測定，過氧化物酶活性(POD)采用愈創(chuàng)木酚法［10］測定，丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度用硫代巴比妥酸法［11］測定，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用蒽酮比色法［12］測定，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)用考馬斯亮藍G250顯色法測定［13］。測定可容性蛋白、丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶活性的材料于冰箱中－70℃保存，測定可溶性糖的材料貯藏于－20℃。待取樣完成后進行統(tǒng)一測定。

數(shù)據(jù)分析:對每個時間段內(nèi)的指標(biāo)進行3個重復(fù)測定，取平均值代表這個時期的指標(biāo)水平。采用Pearson相關(guān)分析法分析對應(yīng)時間的嫁接體死亡率和各指標(biāo)間的相關(guān)性，所使用軟件為SPSS 19．0。

2 結(jié)果與分析

2．1 嫁接組合的成活率

在油茶芽苗砧結(jié)合部傷口愈合過程中由于嫁接不親和等因素導(dǎo)致部分植株死亡，其典型特征為:植株葉片缺少光澤，顏色由深綠色變成淺黃色，腋芽枯萎，最后葉片脫落，接穗干枯，結(jié)合部死亡。2個嫁接組合的死亡率見表1。4/18結(jié)合部在發(fā)育過程中死亡率要低于18/18結(jié)合部(除第5天外)，且都表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢;4/18結(jié)合部死亡率分別在第7天、第15天出現(xiàn)2次較大值，分別為2．20%、2．17%;18/18結(jié)合部死亡率在第15天出現(xiàn)最大值，值為6．42%，是同時期4/18號結(jié)合部死亡率的2．96倍?？梢?，4/18嫁接體成活率要高于18/18嫁接體成活率，且結(jié)合部成活的關(guān)鍵期在嫁接后的半個月內(nèi)。

2．2 嫁接組合的理化指標(biāo)

2．2．1 SOD活性

從表1可以看出:4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部的SOD活性在嫁接后24 h內(nèi)均呈現(xiàn)先下降后上升再下降再上升的趨勢，嫁接后第3天至第55天先下降后上升最后趨于穩(wěn)定;嫁接后0 h～55 d(除第25天)，4/18結(jié)合部的SOD活性均低于18/18結(jié)合部;前24 h內(nèi)差值均較大，差值最大出現(xiàn)在嫁接后第4小時，達到116%;4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部在嫁接后SOD活性均出現(xiàn)3次較大值。4/18結(jié)合部分別在嫁接后第11小時、第24小時、第5天出現(xiàn)較大值;18/18結(jié)合部分別在嫁接后第6小時、第24小時、第7天出現(xiàn)較大值;4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部在嫁接后SOD活性值最低點都出現(xiàn)在嫁接后第15天。表明嫁接后24 h內(nèi)SOD活性變化劇烈，結(jié)合部可能已經(jīng)形成愈傷組織，嫁接后第15天接穗的愈傷組織與砧木的愈傷組織可能已經(jīng)連接。

2．2．2 CAT活性

嫁接后24 h內(nèi)，2個嫁接組合CAT活性均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，4/18結(jié)合部CAT活性均要高于18/18結(jié)合部的(除第0、24小時外);嫁接后24 h至55 d，2個嫁接組合CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;嫁接后24 h至第9天，4/18結(jié)合部CAT活性值開始低于18/18結(jié)合部的(除第5天外);4/18結(jié)合部，分別在第6小時、第5天、第25天出現(xiàn)3次較大值，18/18結(jié)合部在嫁接后的第3、7天出現(xiàn)2次較大值(表1)。在第3天，18/18結(jié)合部可能已經(jīng)形成了大量的愈傷組織;在第25天，4/18結(jié)合部可能已經(jīng)充分愈合。

2．2．3 POD活性

在嫁接后24 h內(nèi)4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢;而4/18結(jié)合部POD活性出現(xiàn)了5次較大值，分別在嫁接后4 h、11 h、24 h、7 d、25 d;而18/18結(jié)合部的POD活性變化平緩，分別在第6小時、第3天、第35天出現(xiàn)3次較大值(表1)。嫁接后24 h內(nèi)，由于對機體機械傷害起保護作用，POD活性值變化劇烈;4/18結(jié)合部嫁接后第7天可能是愈傷組織的接觸時期，嫁接后第25天、第35天可能分是別4/18嫁接體、18/18嫁接體愈傷組織分化維管束的高峰時期，這一時期4/18嫁接體要早于18/18嫁接體，并有可能于這一時期形成貫通砧木和接穗的維管束橋。

2．2．4 MDA質(zhì)量摩爾濃度

在嫁接后24 h內(nèi)，4/18結(jié)合部在第6小時出現(xiàn)第1次較大值，18/18結(jié)合部出現(xiàn)2次較大值，分別為第4小時和第16小時;4/18結(jié)合部MDA質(zhì)量摩爾濃度在嫁接后24 h至55 d內(nèi)均低于18/18結(jié)合部(除第5天、第15天)且都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最后恢復(fù)至起始水平，并且都出現(xiàn)一個較大值，分別為第15天和第25天(表1)。表明，在嫁接后24 h內(nèi)，愈傷組織可能已經(jīng)出現(xiàn);4/18結(jié)合部在第15天和18/18結(jié)合部在第25天死亡率過高可能與膜質(zhì)過氧化作用有關(guān)。

表1 油茶不同芽苗砧嫁接組合死亡率及生理指標(biāo)

2．2．5 可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如表1所示:在嫁接后24 h內(nèi)4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，在第11小時出現(xiàn)第1次較大值，而18/18結(jié)合部可溶糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降的趨勢;嫁接后24 h至55 d，2個嫁接組合結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈先上升后下降的趨勢，且嫁接后第24小時至第25天，4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)要低于4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，4/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第15天出現(xiàn)一次較大值，18/18結(jié)合部可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在第3天、第7天、第15天出現(xiàn)3次較大值。

2．2．6 可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

如表1所示:嫁接后，4/18結(jié)合部可容性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均要高于18/18結(jié)合部(除0 h);在嫁接24 h內(nèi)，4/18結(jié)合部呈下降的趨勢，而18/18結(jié)合部可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先下降后升高再下降再升高的趨勢;在嫁接24 h后，2個嫁接組合均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。2個嫁接組合在第15天后可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)都逐步上升，這可能與這一時期維管束開始分化并且逐步形成砧穗間的維管束橋有關(guān)。

2．3 嫁接組合理化指標(biāo)間的相關(guān)性

從表2中可以看出，4/18嫁接體死亡率與其他指標(biāo)相關(guān)程度大小為:可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞MDA質(zhì)量摩爾濃度＞可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞SOD活性＞POD活性＞CAT活性。死亡率與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)達－0．73，呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDA質(zhì)量摩爾濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0．65，與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，與SOD活性呈負(fù)相關(guān)，與POD活性呈正相關(guān)。POD活性與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。18/18嫁接體死亡率與其他指標(biāo)相關(guān)程度大小為:可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞MDA質(zhì)量摩爾濃度＞SOD活性＞POD活性＞CAT活性。死亡率與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)達－0．49，呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDA質(zhì)量摩爾濃度呈顯著正相關(guān)，與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0．62，與SOD活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與POD呈正相關(guān)。POD活性與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。

表2 油茶芽苗砧嫁接組合結(jié)合部生理指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系

3 結(jié)論與討論

在親和性研究中，成活率是判斷嫁接親和力的常用指標(biāo)，可以作為判斷砧穗組合的短期嫁接親和性［14］。在該試驗中4/18，嫁接體成活率要明顯高于18/18嫁接體成活率且結(jié)合部成活的關(guān)鍵期在嫁接后的半個月內(nèi)，與馮金玲等［15］對油茶嫁接體親和性的研究一致;在較親和的嫁接體結(jié)合部中SOD、POD酶活性高峰出現(xiàn)的時間較早，這與蘇媛［7］對黃瓜嫁接體的研究結(jié)果一致;并且在較親和的嫁接體結(jié)合部的SOD活性較低，POD活性要高，這分別與曲云峰［16］在大扁杏(Prunus armeniaca×sibirica)上的研究和嚴(yán)毅等［17］在葡萄柚(Citrus paradisi)上的研究結(jié)果一致;而嫁接結(jié)合部CAT活性與嫁接體親和性沒有一定的聯(lián)系，不能直接作為反映嫁接體親和性關(guān)系的指標(biāo)。

嫁接體愈傷組織的形成需要大量的糖類物質(zhì)［18］，并且在水分脅迫下，其含量隨脅迫程度的加深而呈增大的趨勢［19］。在嫁接后1～15 d，18/18嫁接體的死亡率和可溶性糖含量都呈逐步上升趨勢并高于4/18嫁接體，可能與嫁接體結(jié)合部愈傷組織的形成與分化有關(guān)，也可能因為嫁接后嫁接體發(fā)育前期砧穗并未愈合，而18/18嫁接組合的接穗葉片較大，受水分脅迫更嚴(yán)重有關(guān)。

可溶性蛋白的積累與細胞的分裂活動有關(guān)，嫁接口的愈合需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，以增進嫁接后細胞分裂和愈傷組織的形成［6］。本試驗結(jié)果表明:4/18結(jié)合部和18/18結(jié)合部可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢與嫁接體愈合階段有關(guān);在愈合前期由于蛋白質(zhì)在代謝過程中的合成代謝速度慢于分解代謝的速度，蛋白質(zhì)含量逐漸減少，而在嫁接體愈合后期，當(dāng)砧穗間維管束橋形成，砧穗融為一個整體后進入了正常的生長發(fā)育階段，嫁接體中的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始逐漸增加，在較親和的嫁接體結(jié)合部的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

MDA是膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，其積累是自由基毒害作用的表現(xiàn)［7］，同時可以作為判斷植物對逆境條件反應(yīng)強弱的一個重要指標(biāo)［20］。4/18結(jié)合部MDA質(zhì)量摩爾濃度與嫁接體死亡率呈極顯著正相關(guān)，18/18結(jié)合部MDA質(zhì)量摩爾濃度與嫁接體死亡率呈顯著正相關(guān)，并且在較親和的嫁接體結(jié)合部的MDA質(zhì)量摩爾濃度的高峰較早，含量較低。

［1］莊瑞林，周啟仁，姚小華，等．中國油茶［M］．北京:中國林業(yè)出版社，2008:1－5．

［2］羅正榮，胡春根，蔡禮鴻．嫁接及其在植物繁殖和改良中的作用［J］．植物生理學(xué)通訊，1996，32(1):59－63．

［3］陳紅，王永清，袁媛，等．茄子/番茄嫁接體發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)含量、POD、CAT和SOD活性及其同工酶研究［J］．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，24(2):144－147．

［4］胡艷青．黃瓜嫁接初期生物學(xué)機理的初步研究［D］．呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008．

［5］陳少裕．膜脂過氧化對植物細胞的傷害［J］．植物生理學(xué)通訊，1991，27(2):84－90．

［6］孫華麗，宋健坤，李鼎立，等．梨不同嫁接組合嫁接愈合過程中生理動態(tài)變化研究［J］．北方園藝，2013(16):25－29．

［7］蘇媛．黃瓜嫁接愈合過程中生物、化學(xué)變化與解剖構(gòu)造的觀察［D］．呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007．

［8］陳建勛，王曉峰．植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］．廣州:華南理工大學(xué)出版社，2002:119－120．

［9］鄒琦．植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000:169－170．

［10］王學(xué)奎．植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］．2版．北京:高等教育出版社，2006:167－168．

［11］李合生，趙世杰．植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］．北京:高等教育出版社，2002:260－261．

［12］王學(xué)奎．植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］．2版．北京:高等教育出版社，2006:202－204．

［13］王學(xué)奎．植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］．2版．北京:高等教育出版社，2006:190－192．

［14］王莉，王圣梅，黃宏文．獼猴桃屬種間嫁接親和性試驗研究及抗根結(jié)線蟲砧木的初步篩選［J］．武漢植物學(xué)研究，2001，19(1):47－51．

［15］馮金玲，楊志堅，陳輝，等．油茶芽苗砧嫁接體的親和性生理［J］．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，40(1):24－30．

［16］曲云峰．大扁杏嫁接成活生理生化特性研究［D］．楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007．

［17］嚴(yán)毅，何承忠，李賢忠，等．9個葡萄柚品種與曼賽龍柚嫁接生理酶活性研究［J］．中國南方果樹，2012，41(2):50－53．

［18］鄭炳松，劉力，黃堅欽，等．山核桃嫁接成活的生理生化特性分析［J］．福建林學(xué)院學(xué)報，2002，22(4):320－324．

［19］喻方圓，徐錫增，Guy R D．水分和熱脅迫對苗木針葉可溶性糖含量的影響［J］．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2004，28(5):1－5．

［20］Giannopolitis C N，Ries S K．Superoxide dismutasesⅠ:Occurrence in higher plants［J］．Plant Physiology，1977，59(2):309－314．