馬尾松內(nèi)生真菌的分離鑒定及多樣性1)

鄧慧華

(龍巖市林業(yè)科學(xué)研究所，龍巖，364000)

植物內(nèi)生真菌泛指那些在其生活史中的某一階段或在整個(gè)生活史中都生活在植物組織內(nèi)部，但并沒有引起植物組織明顯病害癥狀的一類真菌［1-2］。其普遍存在于各種植物體內(nèi)，分布在植物根、莖、葉等器官表皮下的組織中，與宿主植物在長(zhǎng)期演化中互惠互利，共同生長(zhǎng)［3］。近些年來，前人進(jìn)行了很多關(guān)于內(nèi)生真菌的研究［4-5］，內(nèi)生真菌應(yīng)用價(jià)值逐漸引起人們的重視。

馬尾松(Pinus massoniana)是我國(guó)松屬樹種中分布最廣的重要用材樹種，富含松脂，是中國(guó)主要的產(chǎn)脂樹種。有關(guān)馬尾松內(nèi)生真菌的研究鮮見報(bào)道。筆者曾對(duì)馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂菌株及其產(chǎn)油脂效果進(jìn)行研究［6-7］。筆者對(duì)馬尾松進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離純化，通過形態(tài)學(xué)鑒定確定馬尾松內(nèi)生真菌的種類及其在各組織中的分布，并分析馬尾松內(nèi)生真菌的生物多樣性，為豐富馬尾松內(nèi)生真菌資源提供依據(jù)，為馬尾松內(nèi)生真菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

馬尾松樣品來源:馬尾松樣品采自福建省漳平五一國(guó)有林場(chǎng)。采樣時(shí)挑選生長(zhǎng)性狀良好、無病蟲害癥狀的健康植株，分根、莖、葉進(jìn)行采集。根、莖采集10 cm 以上的條段，樣品從植株分離后，用沾水的棉花包住傷斷處，裝于密封的塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室于冷藏箱中低溫保鮮備用。

培養(yǎng)基的配方及制作:PDA 固體培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸20～30 min，4層紗布過濾。加入葡萄糖20 g，瓊脂18 ～20 g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，補(bǔ)足水分定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

內(nèi)生真菌的分離:采用組織塊法分離內(nèi)生真菌［8-9］。將馬尾松根、莖和葉分別剪成3 ～5 cm 的小段，用蒸餾水沖洗干凈后，無菌條件下用75%乙醇表面消毒2～5 min，再將樣品放人0．1%的升汞溶液中進(jìn)一步消毒10～30 s，最后用無菌水沖洗3 次。用無菌吸水紙吸干表面水分，用刀片將根和莖切成0．3～0．5 cm2小塊，將葉切成0．3 cm 的小段，接入PDA 培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)箱中27 ℃避光培養(yǎng)3～7 d。

內(nèi)生真菌的純化:采用菌絲頂端純化法［10-11］，待組織塊周圍長(zhǎng)出菌絲，挑取尖端部分轉(zhuǎn)接至新的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上，逐步純化獲得純培養(yǎng)。將分離純化后的菌株接種于固體斜面PDA 培養(yǎng)基上，對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，保存?zhèn)溆茫?2］。

菌種鑒定:主要根據(jù)宏觀的菌落特征、微觀的個(gè)體特征及一些生物學(xué)特性，對(duì)分離到的馬尾松內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類［13］。挑取純化的真菌菌絲，接種于PDA 培養(yǎng)基上，采用3 點(diǎn)接種法培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面特征;采用點(diǎn)植法或載玻片培養(yǎng)法等制成玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌種在培養(yǎng)過程中菌絲形態(tài)、個(gè)體發(fā)育、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)等特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》［14］及有關(guān)資料對(duì)其進(jìn)行鑒定，確定真菌的分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2．1 馬尾松內(nèi)生真菌的分離鑒定及多樣性

經(jīng)表面消毒和分離純化，從采集的馬尾松根、莖、葉樣品中共分離到102 株內(nèi)生真菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和鑒定，初步將其鑒定為11 個(gè)屬，分屬于6 科6 目4 綱3 門。其種類組成及菌落形態(tài)特征見表1。由表1 可以看出，分離到的馬尾松內(nèi)生真菌中毛霉屬(Mucor)屬于接合菌亞門(Zygomycotina)，生赤殼屬(Bionectria)屬于子囊菌門(Ascomycota)，其余9個(gè)屬歸屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)，分別分屬于絲孢綱(Hyphomycetes)和腔孢綱(Coelomycetes)。其中絲孢綱(Hyphomycetes)最多，包括叢梗孢目(Moniliales)、叢梗孢科(Moniliaceae)的木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、叢梗孢屬(Monilia)、曲霉屬(Aspergillus);絲孢目(Hyphomycetales)、絲孢科(Hyphomycetaceae)的擬青霉屬(Paecilomyces);瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)的鐮刀菌屬(Fusarium)，共6個(gè)屬;腔孢綱(Coelomycetes)3 個(gè)屬，為球殼孢目(Sphaeropsidales)、球殼孢科(Sphaeropsidaceae)的莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)和葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)。

表1 馬尾松內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

2．2 馬尾松不同器官上的內(nèi)生真菌的分布

內(nèi)生真菌在馬尾松不同器官組織的菌株數(shù)量和涉及屬的數(shù)目情況見表2。

表2 馬尾松不同器官內(nèi)生真菌菌株數(shù)量

馬尾松內(nèi)生真菌在根、莖、葉中均有分布。從馬尾松的根部分離到12 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的11．76%，涉及6 個(gè)屬，占總屬數(shù)的54．55%;從莖部分離到23 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的22．55%，涉及9個(gè)屬，占總屬數(shù)的81．82%;從葉部分離到67 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的65．69%，涉及11 個(gè)屬，占總屬數(shù)的100%。結(jié)果表明，從葉部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量和涉及屬的數(shù)目最多，莖部次之，從根部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量和涉及屬的數(shù)目均為最少。

馬尾松內(nèi)生真菌在不同器官的種群分布情況見表3。在分離出的102 株馬尾松內(nèi)生真菌中，毛霉屬30 株，占總菌株數(shù)的29．41%，在根、莖、葉中的分布分別為4、6、20 株;木霉屬24 株，占總菌株數(shù)的23．53%，在根、莖、葉中的分布分別為3、8、13 株。毛霉屬和木霉屬為馬尾松內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢(shì)屬。曲霉屬11 株，占總菌株數(shù)的10．78%，在根、莖、葉中的分布分別為2、2、11 株;擬莖點(diǎn)霉屬9 株，占總菌株數(shù)的8．82%，在根、莖、葉中的分布分別為1、0、8 株;莖點(diǎn)霉屬8 株，占總菌株數(shù)的7．84%，在根、莖、葉中的分布分別為0、2、6 株;青霉屬5 株，占總菌株數(shù)的4．90%，在根、莖、葉中的分布分別為0、2、6 株。曲霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬、莖點(diǎn)霉屬和青霉屬是馬尾松內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢(shì)屬。其余屬菌株數(shù)相對(duì)較少，為非優(yōu)勢(shì)屬。

表3 馬尾松不同器官內(nèi)生真菌的種群分布情況

從表3 可以看出，分離出的馬尾松內(nèi)生真菌11個(gè)屬中，毛霉屬、木霉屬、青霉屬、曲霉屬在根、莖、葉中均有分布;叢梗孢屬、擬青霉屬、莖點(diǎn)霉屬、生赤殼屬、葉點(diǎn)霉屬在莖和葉部有分布，在根部無分布;鐮刀菌屬、擬莖點(diǎn)霉屬在根和葉部有分布，在莖部無分布。各個(gè)屬在葉部的分布均為最多。

3 討論

對(duì)馬尾松的根、莖、葉部?jī)?nèi)生真菌的分離鑒定和多樣性分析表明，馬尾松內(nèi)生真菌的種類具有多樣性，在不同器官上的種群和數(shù)量分布也具有豐富的多樣性，但不同器官的內(nèi)生真菌在數(shù)量和種群分布上都存在較大差異。由葉分離出的內(nèi)生真菌株數(shù)和屬的數(shù)量都高于根和莖部分。這與其他樹種內(nèi)生真菌的相關(guān)研究結(jié)果存在差異［15］。宋萍等［16］對(duì)雷公藤(Tripterygium wilfordii)植物內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，從植株枝中分離到的菌株數(shù)量高于根和葉;高智輝等［17］從從核桃(Juglans regia)的根、莖、葉內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌為莖部最多，葉部次之，根部最少;竇學(xué)娥［18］進(jìn)行桑樹內(nèi)生真菌分離，結(jié)果根部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量最多，莖部次之，葉部最少。馬尾松內(nèi)生真菌分離過程中，由于根和莖的橫切面會(huì)分泌較多油脂，阻礙了根和莖組織塊與PDA 培養(yǎng)基的接觸，接入培養(yǎng)基平板后，油脂在平板表面的散布也不利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)，所以根和莖部分離出的內(nèi)生真菌數(shù)量較少。其中根部分離的數(shù)量最少，這也可能是由于根系分泌物影響了根際微生物的生長(zhǎng)。所分離的植物內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類還與取樣時(shí)間、植物種類、氣候條件、生長(zhǎng)年限、分離方法、生長(zhǎng)環(huán)境、取樣數(shù)量等因素有關(guān)。本研究的馬尾松樣品采自“國(guó)家級(jí)馬尾松重點(diǎn)林木良種基地”福建省漳平五一國(guó)有林場(chǎng)，分離到的內(nèi)生真菌具有典型性和代表性。如何解決馬尾松根、莖橫切面油脂分泌對(duì)內(nèi)生真菌分離的影響有待進(jìn)一步探討。

不同器官內(nèi)生真菌的分布存在差異，可能是由于不同器官組織的結(jié)構(gòu)或者所含化學(xué)成分不同，所以入侵、生長(zhǎng)的內(nèi)生真菌不同［19］。內(nèi)生真菌的侵染機(jī)理有待進(jìn)一步研究，以更好地掌握內(nèi)生真菌種群分布多樣性的規(guī)律，豐富內(nèi)生真菌資源。

［1］ Petrini O． Fungal endophytes of tree leaves［M］Andrews J H，Hirano S S． Microbial ecology of leaves． New York:Springer Verlag，1991:179-197．

［2］ Ganley R J，Brunsfeld S J，Newcombe G． A community of unknown，endophytic fungi in western white pine［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(27):10107-10112．

［3］ Saikkonen K，W?li P，Helander M，et al． Evolution of endophyteplant symbioses［J］． Trends Plant Science，2004，9(6):275-280．

［4］ 謝安強(qiáng)，洪偉，吳承禎．桉樹內(nèi)生菌對(duì)尾巨桉幼苗抗寒生理指標(biāo)的影響［J］．林業(yè)科學(xué)，2012，48(6):170-174．

［5］ 邢朝斌，龍?jiān)录t，李寶財(cái)，等．刺五加Cu/Zn SOD 的克隆及內(nèi)生真菌對(duì)其表達(dá)的影響［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，41(1):82-85．

［6］ 鄧慧華，洪偉，吳承禎，等．馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂菌株的分離、篩選和鑒定［J］．植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2014，23(2):27-33．

［7］ 鄧慧華，洪滔，吳承禎，等．馬尾松(Pinus massoniana)內(nèi)生真菌的產(chǎn)油脂效果［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2014，20(3):377-381．

［8］ 龔賀，張雷鳴，任偉超，等．膜莢黃芪內(nèi)生真菌的分離與鑒定［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，42(3):141-143．

［9］ 李永，樸春根，賀偉，等．2 個(gè)歐美楊品種樹皮內(nèi)生真菌多樣性及優(yōu)勢(shì)種群動(dòng)態(tài)變化［J］．林業(yè)科學(xué)，2013，49(6):90-96．

［10］ 陳婕，李會(huì)平，黃大莊．楊樹內(nèi)生真菌群落多樣性［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，41(7):115-117，133．

［11］ 郭良棟．內(nèi)生真菌研究進(jìn)展［J］．菌物系統(tǒng)，2001，20(1):148-152．

［12］ 周東坡，平文祥，孫建秋，等．紫杉醇產(chǎn)生菌分離的研究［J］．微生物學(xué)雜志，2001，21(1):18-19．

［13］ 邵力平．真菌分類學(xué)［M］．北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1984．

［14］ 魏景超．真菌鑒定手冊(cè)［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979．

［15］ Carroll G． Fungal endophytes in stems and leaves:from latent pathogen to mutualistic symbiont［J］． Ecology，1988，69(1):2-9．

［16］ 宋萍，洪偉，吳承禎，等．雷公藤內(nèi)生真菌的分離及抗腫瘤活性研究［J］．北華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，10(4):310-313．

［17］ 高智輝，翟梅枝，王云果，等．核桃內(nèi)生真菌的分離鑒定［J］．西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27(5):121-123．

［18］ 竇學(xué)娥．桑樹內(nèi)生真菌的分離鑒定及產(chǎn)油菌Macrophomina phaseolina MOD-1 的研究［D］．山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008．

［19］ 謝麗華，徐焰平，王國(guó)紅，等．茶樹品種、葉片生育期和茶葉化學(xué)成份對(duì)內(nèi)生真菌的影響［J］．菌物研究，2006，4(3):35-41．