PCR 檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因

顧 琳 ，黃 平，宋衍燕，高 艷，邵希鳳，韓曉瑄，韓慶華，王軍波

(1北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191;2北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100021)

金黃色葡萄菌隸屬于葡萄球菌屬，是人類重要的致病菌之一。食品中的金黃色葡萄球菌可能引起食物中毒，其致病因素主要為金黃色葡萄球菌腸毒素。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，目前已發(fā)現(xiàn)18 種腸毒素基因型。腸毒素可耐受100℃煮沸30min 而不被破壞。金黃色葡萄球菌為侵襲性細(xì)菌，產(chǎn)生的腸毒素對腸道破壞性大，所以金黃色葡萄球菌腸炎起病急、中毒癥狀嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉，還會增加慢性病的患病風(fēng)險，1%—5%的急性胃腸炎患者會轉(zhuǎn)變成嚴(yán)重的疾病或慢性病，如風(fēng)濕病、僵硬性脊椎炎、Reiter's 綜合征、營養(yǎng)吸收不良、溶血性尿毒癥、動脈硬化癥和格林巴利綜合癥、肝炎等疾病［1］。2013 年國家衛(wèi)計委通報的《2013 年全國食物中毒事件情況》顯示，微生物性食物中毒事件中毒人數(shù)最多，占總中毒人數(shù)的60.4%，其中主要是由金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的食物中毒。因此及時檢測出食品中的金黃色葡萄球菌及其腸毒素，能夠保障食品安全，維護(hù)公眾健康。本研究通過PCR 技術(shù)檢測食品中檢出的金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶情況，探討與食物中毒發(fā)生相關(guān)的金黃色葡萄球菌腸毒素基因類型。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗室保存菌株，至2012 年共收集食品中檢出的金黃色葡萄球菌22 株，其中食物中毒中檢出17 株、食品中檢出5 株。

1.2 方法

對食品中檢出的金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌菌株分離培養(yǎng)，經(jīng)法國生物梅里埃公司的GP 系統(tǒng)鑒定為金黃色葡萄球菌，再應(yīng)用PCR 檢測每例樣本中sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser 等18 種腸毒素基因的攜帶情況。

1.3 儀器設(shè)備及試劑

全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)VitekⅡcompact (法國)、天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒、伯樂PCR 擴(kuò)增儀S1000 (美國)、毛細(xì)管電泳儀QLAxcel、PCR 試劑:購于達(dá)安基因公司。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Gen Bank 公布的金黃色葡萄球菌18 種腸毒素的基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件及參考文獻(xiàn)［2］，引物由invitrogen 中國公司合成，引物序列見表1。

1.5 DNA 的提取

將純培養(yǎng)的菌株用葡萄球菌溶菌酶裂解細(xì)胞壁，用天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA 的提取。提取物作為PCR 擴(kuò)增的模板。

1.6 PCR 擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件

擴(kuò)增反應(yīng)體系:緩沖液5μL、Taq 酶0.25μL、dNTP3μL、引物1μL、模板1μL，再加滅菌去離子水至25μL。

表1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因引物序列

1.7 毛細(xì)管凝膠電泳

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物按順序放入QIAxcel 全自動毛細(xì)管電泳儀96 孔樣品托盤內(nèi)，在儀器相應(yīng)位置加入卡夾QIAxcel Gel Cartridge、電泳緩沖液和洗滌液(所有試劑平衡至室溫后使用)。鎖定卡夾，運(yùn)行程序。實驗結(jié)果用軟件BioCalculator 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用費(fèi)歇爾精確卡方檢驗對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，認(rèn)為P ＜0.05 時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

22 株金黃色葡萄球菌菌株中檢出19 株攜帶腸毒素基因的菌株，其中攜帶sea 基因的菌株17 株，檢出率77.27%;同時攜帶seb、seg、sei、sem、sen 基因的菌株1 株;同時攜帶seg、sei、sem、sen 的菌株1 株。18種腸毒素基因檢測均為陰性的菌株3 株，占13.64%。食物中毒和食品兩組樣品中腸毒素檢出的陽性率分別為88.23%和80.00%，經(jīng)費(fèi)歇爾精確卡方檢驗對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算累計概率P=1.835 2，在α=0.05 水平上，認(rèn)為食物中毒和食品兩組攜帶腸毒素基因的概率不存在統(tǒng)計學(xué)差異(表2)。

表2 兩組樣品中檢出的金黃色葡萄球菌腸毒素陽性率比較

3 討論

20 世紀(jì)80 年代有研究表明，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒中，攜帶sea、seb、sec、sed、see 基因的金黃色葡萄球菌占95%，另外5%由攜帶其它腸毒素基因的金黃色葡萄球菌引起［3］。然而隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，樣本來源、基因表達(dá)、毒力強(qiáng)度變化等影響，新發(fā)現(xiàn)的腸毒素基因引起的食物中毒應(yīng)引起重視。為了解新發(fā)現(xiàn)的腸毒素基因在食物中毒中的作用，不僅要對不同來源菌株的各型腸毒素基因分布進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究，而且要研究各型腸毒素基因間的關(guān)系、表達(dá)情況、毒素性質(zhì)。

從試驗結(jié)果可以看出，攜帶sea 腸毒素基因的樣本占總樣本量的77.27%，說明在食品中sea 基因的分布更為集中，這與其它研究中各類食品的金黃色葡萄球菌腸毒素基因分型檢測結(jié)果相似［4］。食品樣本中檢出的金黃色葡萄球菌菌株的腸毒素基因攜帶率較高，并且存在多重攜帶的情況。本試驗的22 株金葡菌中2 例攜帶1 種以上腸毒素基因，占9.09%。Janaud 等［5］針對seg、sei 的研究證實，這兩種腸毒素均屬于金葡菌內(nèi)一個名叫腸毒素基因群(Enterotoxin gene cluster，egc)的操縱子，該操縱子位于金黃色葡萄球菌基因島vSAβ 上。Becker等［6］研究表明，egc 與菌株的遺傳背景關(guān)系密切，而與菌株的地域來源及分布無關(guān)，因此二者之間可能存在著協(xié)同作用。趙健等［7］用VIDAS 全自動免疫分析儀測定從醫(yī)院食物中毒患者嘔吐物及相關(guān)食品標(biāo)本中分離培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌腸毒素，陽性檢出率為56.20%，低于本試驗中的結(jié)果，提示金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶與腸毒素蛋白的產(chǎn)生，存在多種因素的影響?；蛟诜g、表達(dá)為蛋白質(zhì)的過程中會受到機(jī)體內(nèi)環(huán)境，以及外界多種因素的影響，因此，盡管檢測出腸毒素基因的存在，但在食品樣本復(fù)雜的環(huán)境因素影響下，并不是每種腸毒素基因都會表達(dá)為具有腸毒素功能的蛋白。蛋白質(zhì)譜分析作為新的研究手段，將成為金黃色葡萄球菌腸毒素蛋白今后探索的方向之一。

［1］金利宗.細(xì)菌性食物中毒的臨床分析［J］.中外健康文摘，2012，9(8):242-243.

［2］申跡，項錦銀，寇巍，洪蘇玲.慢性鼻—鼻竇炎中金黃色葡萄球菌腸毒素基因研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41(30):3134-3136.

［3］柳旭偉，葛文霞.金黃色葡萄球菌腸毒素［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(5):86-89.

［4］李自然.上海市食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因多樣性及分型研究［D］.上海:上海交通大學(xué)，2012.

［5］Jarraud，Peyrat M A，Lim A，et al.A putative nursery of suoerantigens in Staphyococcus aureus ［J］.J Immunol，2001，166(1):669-677.

［6］Becker K，F(xiàn)riendrich A W，Lubritz G.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantigens and exfoliative toxins among strains of staphylococcus aureus isolated from blood and nasal specimens ［J］.J Clin Microbiol，2003，41 (4):1434-1439.

［7］趙健，丁水軍，陸扁，傅丹青.48 株金黃色葡萄球菌的腸毒素分布及其耐藥性研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15(7):841-842.