碘造影劑誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎細(xì)胞凋亡涉及Akt/mTOR信號途徑探討

焦占全 陳軍 劉艷紅 李廣平

·基礎(chǔ)研究·

碘造影劑誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎細(xì)胞凋亡涉及Akt/mTOR信號途徑探討

焦占全 陳軍 劉艷紅 李廣平

目的 探討腎細(xì)胞凋亡在糖尿病大鼠造影劑急性腎損害(CIAKI)發(fā)病中的作用，并研究其對Akt/mTOR信號途徑的影響。方法 雄性SD大鼠24只，遵循體質(zhì)量分層隨機(jī)原則分為正常對照組(N組)、正常+造影劑組(NC組)、糖尿病對照組(D組)和糖尿病+造影劑組(DC組)，每組6只。以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型；10周后經(jīng)股靜脈注射60%泛影葡胺(10 ml/kg)，連續(xù)2 d，建立CIAKI模型24 h后處死大鼠留取標(biāo)本，測血、尿肌酐值；免疫組化法檢測腎內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)；Western Blot定量檢測腎組織內(nèi)Bcl-2、Bax及Akt/mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與D組比較，DC組注射泛影葡胺后血肌酐顯著增加[(103.89±9.01)μmol/L比(71.52±7.03)μmol/L，P=0.000]，而肌酐清除率顯著降低[(1.49±0.33)ml/min比(2.60±0.54)ml/min，P=0.001]；腎內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3陽性表達(dá)量顯著增加(17.55±0.86比10.02±1.48，P=0.000)；抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)則顯著下降，而促凋亡Bax蛋白表達(dá)顯著增加(0.90±0.13比 1.50±0.16；0.92±0.04比 0.51±0.05，均為P=0.000)。糖尿病CIAKI時上游p-Akt和p-mTOR均表達(dá)下調(diào)(0.46±0.08比0.68±0.07，P=0.002；0.19±0.04比0.50±0.07，P=0.000)。結(jié)論 離子型高滲造影劑可能通過抑制糖尿病大鼠Akt/mTOR信號通路磷酸化激活介導(dǎo)腎細(xì)胞經(jīng)線粒體caspase-3途徑凋亡而導(dǎo)致急性腎損傷。

糖尿病； 造影劑急性腎損害； 細(xì)胞凋亡； Akt/mTOR信號通路

造影劑急性腎損害(contrast induced acute kidney injury，CIAKI)已成為醫(yī)院內(nèi)獲得性急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)的主要原因之一。而糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是發(fā)生CIAKI最常見的危險因素[1-2]。細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，無論是高滲還是低滲造影劑，在高血糖(30 mmol/L)條件下細(xì)胞凋亡均顯著加重[3-4]，因此造影劑與高血糖可能對細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，處于生物體內(nèi)復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，是體內(nèi)上游信號的信號整合分子[5-6]。而Akt是細(xì)胞生存的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，mTOR是其下游效應(yīng)信號之一，Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路的活化可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖。Rane等[7]發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞在持續(xù)高糖環(huán)境下出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與Akt活化的抑制有關(guān)，但目前有關(guān)糖尿病時造影劑誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡機(jī)制的體內(nèi)實(shí)驗研究尚未見報道。因此，本研究擬建立可靠的糖尿病CIAKI模型，在體內(nèi)實(shí)驗條件下探討腎細(xì)胞凋亡在糖尿病大鼠CIAKI發(fā)病中的作用，并研究其對Akt/mTOR信號途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物和主要試劑

健康雄性清潔級SD大鼠24只，8周齡，體重(250±20)g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心。鏈脲佐菌素購自Sigma公司；60%泛影葡胺購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；血清肌酐(Scr)試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；caspase-3兔抗大鼠多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；Bcl-2抗體、Bax抗體、Phospho-Akt(Ser473)抗體和Phospho-mTOR(Ser2448)抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 糖尿病大鼠CIAKI模型的建立與分組

給予實(shí)驗動物標(biāo)準(zhǔn)鼠食，自由攝食水，遵循體重分層隨機(jī)原則分為兩組：正常組(12只)，糖尿病組(12只)。禁食12 h，糖尿病組大鼠以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素60 mg/kg建立糖尿病模型，注射后72 h及1周斷尾取血測血糖，以非禁食血糖≥16.7 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)判定糖尿病大鼠模型是否成功。實(shí)驗期間每周測血糖1次，保證血糖≥16.7 mmol/L。

將正常組大鼠再遵循體重分層隨機(jī)原則分為正常對照組(N組，n=6)和正常+造影劑組(NC組，n=6)；將糖尿病組大鼠再遵循體重分層隨機(jī)原則分為糖尿病對照組(D組，n=6)和糖尿病+造影劑組(DC組，n=6)。此后繼續(xù)給予普通飼料，自由攝水，飼養(yǎng)滿10周后NC組和DC組以10%水合氯醛(3 ml/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，采用小切口逐層切開，分離出左(右)股靜脈，經(jīng)靜脈留置針注射60%泛影葡胺(10 ml/kg，推注時間不少于10 min)，1次/d連續(xù)2 d，建立CIAKI模型；N組和D組注射同等量生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集

造模結(jié)束后將大鼠放入代謝籠，留取24 h尿液并記錄尿量。然后以10%水合氯醛(3 ml/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹部正中切口，經(jīng)下腔靜脈抽血5 ml留驗?zāi)I功能等生化指標(biāo)。經(jīng)腹主動脈用冰凍生理鹽水充分灌洗至流出液體清亮。分離兩腎包膜，迅速取下雙腎。左腎去包膜后用10%中性甲醛固定，石蠟包埋后切片行相關(guān)染色；右腎分離后迅速保轉(zhuǎn)至-80℃冰箱凍存，用于Western Blot蛋白定量分析。

1.4 血、尿生化指標(biāo)檢測

按照試劑盒說明書，利用半自動生化儀測定Scr及尿肌酐水平，并計算肌酐清除率。計算公式：肌酐清除率=(尿肌酐×24 h尿量)/(Scr×24×60×體重)。

1.5 免疫組化檢測腎組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，室溫孵育15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加caspase-3兔抗大鼠多克隆抗體，再滴加相應(yīng)的生物素標(biāo)記的二抗，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，加底物3，3′-二甲基聯(lián)苯氨顯色，陽性表達(dá)呈棕黃色著色，光鏡下觀察。每張切片隨機(jī)測定10個完整而不重疊視野，在校正光密度后測定每個視野下陽性反應(yīng)的累積光密度(optical density，IOD)，以累積光密度代表含量密度。

1.6 Western Blot定量分析凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax及Akt/mTOR信號通路蛋白的表達(dá)

組織塊稱重、粉碎，裂解液裂解，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。上樣、10% SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉37℃封閉2 h；加相應(yīng)一抗4℃過夜，加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，X線片顯影成像，將顯色條帶掃描至計算機(jī)中，使用Image J分析軟件分析底片上條帶的光密度值，以靶蛋白/內(nèi)參GAPDH光密度比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)豐度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠CIAKI模型的成功建立

糖尿病大鼠Scr水平與正常大鼠相似，而肌酐清除率稍高(P>0.05)；NC組大鼠注射造影劑后Scr水平稍高于N組，而肌酐清除率水平略低于N組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。值得注意的是，DC組大鼠注射高滲造影劑后Scr水平顯著高于D組[(103.89±9.01)μmol/L比(71.52±7.03)μmol/L，P<0.05]，肌酐清除率顯著低于D組[(1.49±0.33)ml/min比(2.60±0.54)ml/min，P<0.05]，見表1。

2.2 免疫組化法比較各組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3陽性表達(dá)量(×105)

NC組大鼠腎臟caspase-3陽性表達(dá)量較N組略升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(5.48±0.36比4.71±0.28，P=0.151)。D組大鼠腎臟caspase-3陽性表達(dá)量較N組明顯升高(10.02±1.48比4.71±0.28，P=0.000)；而DC組caspase-3陽性表達(dá)量顯著高于D組(17.55±0.86比10.02±1.48，P=0.000)，見圖1。

表1 各組大鼠血肌酐和肌酐清除率比較

注：與N組比較，aP<0.05；與NC組比較，bP<0.05；與D組比較，cP<0.05

A：N組，正常對照組；B：NC組，正常+造影劑組；C：D組，糖尿病對照組；D：DC組，糖尿病+造影劑組

2.3 線粒體Bcl-2家族Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化

N：正常對照組；NC：正常+造影劑組；D：糖尿病對照組；DC：糖尿病+造影劑組

與N組相比，D組大鼠腎臟Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(1.50±0.16比2.56±0.47，P=0.008)；NC組較N組略有下降，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2.24±0.37比2.56±0.47，P=0.720)。DC組大鼠腎臟Bcl-2的表達(dá)較D組顯著下降(0.90±0.13比1.50±0.16，P=0.000)。而Bax蛋白表達(dá)趨勢與之相反，DC組大鼠腎臟Bax蛋白表達(dá)較D組顯著增加(0.92±0.04比0.51±0.05，P=0.000)，見圖2。

2.4 CIAKI時Akt/mTOR信號途徑蛋白表達(dá)變化

NC組、D組大鼠腎臟p-Akt(S473)的表達(dá)顯著低于N組(0.72±0.11比1.01±0.14； 0.68±0.07比1.01±0.14，均P=0.000)；DC組大鼠腎臟p-Akt(S473)的表達(dá)較D組顯著下降(0.46±0.08比0.68±0.07，P=0.002)。與之相似，p-Akt(S473)的下游信號mTOR其磷酸化激活程度，NC組、D組均顯著低于N組(0.73±0.14比0.95±0.12，P=0.001；0.50±0.07比 0.95±0.12，P=0.000)；DC組大鼠腎臟p-mTOR的表達(dá)較D組顯著下降(0.19±0.04比0.50±0.07，P=0.000)，見圖3。

N：正常對照組；NC：正常+造影劑組；D：糖尿病對照組；DC：糖尿病+造影劑組

3 討論

目前，糖尿病是全球第3大非傳染性“流行性”疾病，其代表發(fā)生CIAKI和CIAKI相關(guān)心血管死亡的高危風(fēng)險[1-2]。故此，我們確定了本研究誘導(dǎo)早期糖尿病腎病，并在此基礎(chǔ)上注射高滲造影劑泛影葡胺以誘導(dǎo)建立糖尿病CIAKI模型的方案。最大限度地模擬CIAKI臨床實(shí)際進(jìn)程，以使實(shí)驗得出的結(jié)論更具代表性和說服力。

本實(shí)驗數(shù)據(jù)表明，與正常大鼠相比，病程10周時糖尿病大鼠雖然Scr無明顯升高，但肌酐清除率近乎達(dá)到正常大鼠的兩倍，表明其處于早期糖尿病腎病階段。如前所述，正常大鼠對CIAKI的發(fā)生有“抵抗力”，而糖尿病大鼠注射泛影葡胺后肌酐清除率顯著下降，這表明大鼠在糖尿病腎病狀態(tài)下對于離子型高滲造影劑泛影葡胺更為敏感，腎功能損傷程度更加嚴(yán)重。

近年研究發(fā)現(xiàn)，高血糖狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，推測細(xì)胞凋亡參與了DN的發(fā)生[8-9]。進(jìn)一步的體外研究也證實(shí)，造影劑對高糖狀態(tài)下的腎細(xì)胞凋亡有顯著影響。Wasaki等[3]研究發(fā)現(xiàn)，高糖條件增強(qiáng)了腎小球系膜細(xì)胞對造影劑細(xì)胞毒性的敏感性。O′Donnell等[4]體外培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)無論是高滲還是低滲造影劑，在高血糖(30 mmol/L)條件下細(xì)胞凋亡均顯著加重，故而他們提出造影劑與高血糖對細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。而目前有關(guān)糖尿病時造影劑誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡的體內(nèi)研究尚未見報道，本研究在體內(nèi)實(shí)驗條件下證實(shí)糖尿病大鼠應(yīng)用高滲造影劑后腎細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)顯著升高，這表明離子型高滲造影劑會加重糖尿病大鼠腎細(xì)胞凋亡。許多體外研究已證實(shí)，造影劑可影響B(tài)cl-2基因家族蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡[10-15]。Yano等[12]研究發(fā)現(xiàn)，造影劑誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞凋亡，這一損傷或許是因為下調(diào)了Bax/Bcl-2表達(dá)，隨后增加了caspase-9和caspase-3活性。同樣，我們在體內(nèi)實(shí)驗也證實(shí)機(jī)體在糖尿病基礎(chǔ)狀態(tài)下，離子型高滲造影劑可能通過某種相應(yīng)特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)打破了Bcl-2基因家族中Bcl-2與Bax之間的“平衡”，Bcl-2/Bax比值下調(diào)，此后完全啟動線粒體caspase-3信號通路，促進(jìn)腎細(xì)胞凋亡。

如前所述，Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路的活化可促進(jìn)翻譯過程的啟動，促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖。Brognard等[16]發(fā)現(xiàn)，天然腫瘤抑制蛋白PHLPP可使Akt去磷酸化而失活，從而抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。亦有研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1的活化能對抗UV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Faghiri和Bazan[17]研究PI3K/Akt和mTOR/P70S6K途徑可傳遞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激時的部分生存信號。近來，Rane 等[7]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞在持續(xù)高糖環(huán)境下出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與Akt活化的抑制有關(guān)。Andreucci等[18]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR/P70S6K途徑去磷酸化失活參與了造影劑引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。本研究中各組大鼠腎臟p-Akt(S473)及其下游信號分子p-mTOR的表達(dá)趨勢基本一致：D組低于N組；DC組較D組顯著下降。表明與正常大鼠相比，早期糖尿病腎病階段Akt/mTOR信號途徑磷酸化激活受到抑制；更值得關(guān)注的是離子型高滲造影劑誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟Akt/mTOR途徑去磷酸化失活進(jìn)一步加重。這也驗證了以往體外實(shí)驗的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)Akt/mTOR信號途徑參與抗凋亡機(jī)制，泛影葡胺可經(jīng)Akt/mTOR途徑去磷酸化失活而加重糖尿病大鼠腎細(xì)胞凋亡。

此外，我們既往的研究還發(fā)現(xiàn)，已存在基礎(chǔ)腎損傷時注射造影劑更易導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)改變，誘發(fā)急性腎損傷[19]。糖尿病大鼠注射高滲造影劑泛影葡胺后觸發(fā)腎內(nèi)一系列的信號途徑的表達(dá)改變，上游Akt/mTOR信號途徑顯著去磷酸化失活，機(jī)體細(xì)胞抗凋亡防御能力下降，這些上游信號的整合結(jié)果影響了Bcl-2/Bax比值，經(jīng)過內(nèi)源性線粒體caspase-3途徑誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡。可見糖尿病時高滲造影劑促發(fā)的腎細(xì)胞凋亡是上述信號“網(wǎng)絡(luò)”的共同調(diào)節(jié)傳遞信息的結(jié)果?？傊x子型高滲造影劑可能通過抑制糖尿病大鼠Akt/mTOR信號通路磷酸化激活介導(dǎo)腎細(xì)胞經(jīng)線粒體caspase-3途徑凋亡而導(dǎo)致急性腎損傷。

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(本文編輯：譚瀟)

Akt/mTOR expression is involved in iodinated contrast media induced renal cell apoptosis in diabetic rats

JiaoZhanquan1,ChenJun1,LiuYanhong2,LiGuangping1.

1TianjinKeyLaboratoryofIonic-MolecularFunctionofCardiovascularDisease,TianjinInstituteofCardiology,DepartmentofCardiology,theSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211,China; 2DepartmentofCardiology,TianjinThirdCentralHospital

LiGuangping,Email:tjcardiol@126.com

Objective To investigate molecular mechanisms of renal cell apoptosis on CIAKI in vivo, especially the involvement of Akt/mTOR signal pathways. Methods Diabetic Sprague-Dawley rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin. Ten weeks later the normal and diabetic rats were administered 60% meglumine diatrizoate (DTZ) or normal saline (10 ml/kg) injection for two days continuously. 24 h after the operation, the rats were killed, stored blood samples for examining blood creatinine and kidneys for immunohistochemistry and western blotting analysis. The expression of caspase-3 in the kidney was investigated by immunohistochemistry. Meanwhile, quantitative analysis of the Bcl-2, Bax, upstream signal molecule p-Akt and p-mTOR protein expression by western blotting was used to study renal cell apoptosis on CIAKI. Results Compared with diabetic group (D group), the serum creatinine was significantly increased in diabetes+contrast media (DTZ) group (DC group) after operation [(103.89±9.01)μmol/Lvs. (71.52±7.03)μmol/L,P=0.000]. The creatinine clearance rate (Ccr) was also significantly decreased in DC group after operation[(1.49±0.33)ml/minvs. (2.60±0.54)ml/min,P=0.001]. Especially in the diabetic kidney, the expression of caspase-3 was also significantly increased after intravenous injection HOCM compared with normal saline. And the expression of anti-apoptosis Bcl-2 protein was significantly decreased in DC group after the induction of DTZ, while the expression of promoting apoptosis protein Bax was significantly increased (0.90±0.13vs. 1.50±0.16; 0.92±0.04vs. 0.51±0.05, bothP=0.000). The activity of upstream signal molecule p-Akt and p-mTOR was significantly decreased (0.46±0.08vs. 0.68±0.07,P=0.002; 0.19±0.04vs. 0.50±0.07,P=0.000). Conclusions The ionic high osmolality CM induce severe renal cells apoptosis in diabetic rats through activating the caspase-3 apoptotic pathway that may be mediated by upstream Akt/mTOR (inhibiting p-Akt and p-mTOR expression) signal pathways.

Diabetes mellitus； Contrast induced acute kidney injury； Apoptosis； Akt/mTOR signal pathways

10.3969/j.issn.1007-5410.2015.03.012

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目(2012KZ079)

300211 天津市心血管病離子與分子機(jī)能重點(diǎn)實(shí)驗室 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科 天津心臟病學(xué)研究所(焦占全、陳軍、李廣平)；天津市第三中心醫(yī)院心臟科(劉艷紅)

李廣平，電子郵箱：tjcardiol@126.com

2014-10-21)

ThisworkwassupportedbyagrantfromtheScienceandTechnologyFoundationofTianjinMunicipalHealthBureau(No.2012KZ079)