孕酮對反復自然流產小鼠白介素8表達的調節(jié)作用

宋 芳 馮若鵬 趙紫薇 陳 晶 賀 帥 陳小艷

1.包頭醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室（014010）；2.包頭醫(yī)學院形態(tài)學實驗室

妊娠期母體產生大量的雌激素、孕激素等，它們能抑制輔助性T細胞（Th）1亞群反應，促進Th2細胞亞群 反 應［1－2］。Fotiadou 等［3］和 Piccinni等［4］發(fā)現孕酮可以促進Th2型細胞亞群分泌的細胞因子，如白介素（IL）－4和IL－5的高水平表達，參與免疫調節(jié)，減少流產發(fā)生。因此，有望通過調整孕酮水平對Th1／Th2型細胞因子間的平衡進行調節(jié)，有效地降低流產率。IL－8為Th1型細胞因子，表現為免疫殺傷作用，可引發(fā)自然流產，本實驗通過比較孕酮干預的 CBA／J×DBA／2 小鼠流產模型和 CBA／J×BALB／c小鼠正常妊娠模型IL－8及其mRNA的變化，探討孕酮對自然流產小鼠IL－8的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人IL－8多克隆抗體為Santa Cruz公司產品；孕酮和IL－8酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒、PV－6001試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；RNA抽提試劑RNArose Reagent購于上海華舜生物工程有限公司；通用逆轉錄多聚酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒購于北京博大泰克生物基因技術有限責任公司。

1.2 建立小鼠自然流產模型

將雌性CBA／J小鼠分別與雄性DBA／2或BALB／c小鼠合籠交配，次日晨檢出陰栓者記為妊娠1d，分別建立自然流產模型與正常妊娠模型。于妊娠14d處死孕鼠，計算胚胎吸收率（R），以評價模型成功與否。R＝Re／（Re＋F）（Re為吸收胚胎數，F為存活胚胎數）。

1.3 實驗分組

將自然流產小鼠分為兩組：孕酮組和模型組，孕酮組于妊娠5d腹腔注射黃體酮溶液（2mg／kg），每日1次，維持至妊娠14d；模型組同步注射等量的生理鹽水；正常妊娠小鼠不做任何處理。每組10只小鼠。

1.4 ELISA 檢 測

3組孕鼠均于妊娠14d采用眼球摘除術收集血樣，2000rpm／min離心10min，取血清，用 ELISA試劑盒檢測孕酮及IL－8水平。以標準品2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、0pg／ml所對應的濃度作為縱坐標，OD值作為橫坐標在半對數紙上作圖，畫出標準曲線。所有OD值均減去空白管值后再計算。根據樣品OD值在該標準曲線圖上查出相應樣品中孕酮、IL－8的含量。

1.5 免疫組織化學染色

將符合實驗條件的各組小鼠絨毛、蛻膜組織制備成石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；0.3%H2O2·甲醇室溫孵育30min，封閉內源性過氧化物酶；滴加兔抗人IL－8抗體工作液（1∶200），4℃過夜；滴加羊抗兔IgG抗體－辣根過氧化物酶（HRP）多聚體，室溫孵育30min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）－H2O2室溫顯色，Mayer蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。用捷達801圖像分析系統(tǒng)分別測定各組絨毛、蛻膜組織IL－8蛋白表達的相對含量。

1.6 RT－PCR

各組小鼠絨毛、蛻膜組織，生理鹽水洗凈后分別投入液氮到組織硬化，然后凍存于－80℃冰箱，以供提取RNA用。按通用RT－PCR試劑盒所示步驟，將mRNA反轉錄為cDNA，用所得cDNA進行PCR反應，PCR產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，采用JeDa 801凝膠成像分析系統(tǒng)對DNA條帶進行灰度掃描。

將同一標本IL－8DNA條帶的灰度值／β-actin DNA條帶的灰度值＝IL－8mRNA的相對含量

IL－8引物序列：上游引物5＇－GACAAGAGCCAGGAAGAAAC－3＇，下游引物5＇－CTACAACAGACCCACACAATAC－3＇，擴增片段長度459bp；βactin引物序列：上游引物5＇－CGGGAAATCGTGCGTGACAT－3＇，下游引物5＇－GAACTTTGGGGGATGCTCGC－3＇，擴增片段長度712bp。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數據采用SPSS 11.5軟件分析處理，用均值±標準差（）表示，經方差齊性檢驗后，用單因素方差分析（one－way ANOVA）中的LSD法處理，并進行組間兩兩比較，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ELISA 檢 測

孕酮組血清孕酮水平高于模型組，而IL－8水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。孕酮組血清孕酮、IL－8水平與正常組比較均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組血清孕酮、IL－8水平比較（）

表1 各組血清孕酮、IL－8水平比較（）

＊與孕酮組比較P＜0.01

組別 孕酮（ng／ml） IL－8（pg／ml）孕酮組 84.91±10.05 615.23±213.62模型組 41.83±9.77＊ 1653.14±321.25＊正常組 91.27±10.91 653.87±183.43

2.2 免疫組織化學染色

在絨毛和蛻膜組織中，各組IL－8的蛋白表達主要定位在絨毛上皮細胞、蛻膜細胞及腺上皮細胞的細胞質內，呈棕黃色顆粒，陽性反應強弱不等（圖1）。

圖1 IL－8蛋白在各組絨毛和蛻膜組織中的表達（HRP，200×）

圖像分析結果顯示：孕酮組IL－8的蛋白相對含量在絨毛組織、蛻膜組織的蛻膜細胞和腺上皮細胞中均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），與正常組比較均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 各組IL－8在絨毛、蛻膜組織中的蛋白相對含量比較（）

表2 各組IL－8在絨毛、蛻膜組織中的蛋白相對含量比較（）

與孕酮組比較＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

組別 絨毛上皮 蛻膜蛻膜細胞 腺上皮孕 酮 組 0.067±0.028 0.094±0.025 0.104±0.021模型 組 0.135±0.012＊＊ 0.107±0.024＊ 0.116±0.019＊正常 組 0.059±0.021＃ 0.088±0.022＃ 0.110±0.017＃

2.3 RT－PCR實驗

2.3.1 擴增產物的定性分析 IL－8mRNA在各組絨毛、蛻膜組織中均有表達，IL－8和β-actin的RTPCR產物與理論長度一致見圖2。

圖2 IL－8mRNA在各組絨毛、蛻膜組織表達的RT－PCR分析

2.3.2 擴增產物的半定量分析 在絨毛組織和蛻膜組織中，孕酮組IL－8mRNA的表達均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 各組IL－8mRNA在絨毛、蛻膜組織相對含量比較（）

表3 各組IL－8mRNA在絨毛、蛻膜組織相對含量比較（）

與孕酮組比較＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

組別 絨毛組織 蛻膜組織孕酮組 61.28±4.13 72.14±3.04模型組 85.72±2.63＊＊ 82.23±4.11＊正常組 58.33±2.87＃ 70.55±3.66＃

3 討論

目前，不明原因的自然流產已被公認為與機體的免疫因素有關，且Th1／Th2細胞因子平衡對正常妊娠是十分重要的。正常妊娠是以Th2型細胞因子為主的生理現象，當發(fā)生向Th1型細胞因子的偏離時，可能會導致自然流產［5－7］。IL是由多種細胞分泌的在免疫調節(jié)過程中起重要作用的細胞因子，國內外已有學者研究了自然流產患者血清或組織中IL－2、IL－4、IL－5、IL－6、IL－8、IL－10等的變化，但關于IL－8與自然流產的相關性研究的文獻報道較少，Madhappan等［8］、Koumantaki等［9］以 及 國 內 學 者齊衛(wèi)紅［10］和黃江寧等［11］均是采用ELISA法檢測反復自然流產患者血清IL－8的含量，且得出結論不一致。我們在前期工作中采用RT－PCR、Western blot和免疫組織化學染色技術在自然流產母胎界面進行研究，發(fā)現并報道：反復自然流產患者絨毛、蛻膜組織中IL－8mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常妊娠婦女，提示IL－8參與反復自然流產的病理過程。然而引發(fā)自然流產的免疫機制相當復雜，Th1／Th2型細胞因子間的平衡受多種因素的調控，如何調節(jié)正常的免疫平衡，維持正常妊娠的進行，減少流產的發(fā)生是關鍵，因此，有必要進一步研究引發(fā)自然流產的調節(jié)機制。

眾所周知，蛻膜的正常生長和發(fā)育對妊娠的維持起著相當重要的作用，而孕酮是維持早孕期蛻膜正常形態(tài)和功能的必要激素。由于臨床研究受到患者遺傳背景、生活習慣、工作環(huán)境等諸多復雜因素的影響，而采用近交系小鼠可以排除混雜因素，CBA／J和DBA／2是較為常用的近交品系小鼠。CBA／J×DBA／2小鼠具有反復自然流產的特點，胚胎吸收率恒定于30%～45%，而CBA／J×BALB／c小鼠的胚胎吸收率僅為5%～10%。目前普遍認為，免疫因素是這一動物模型發(fā)生自然流產的主要原因，因此它們是用于研究母胎免疫調節(jié)機制較為理想的動物模型［12－13］。

ELISA實驗結果表明：外源性給予黃體酮的自然流產小鼠，其血清孕酮水平明顯升高，而IL－8水平明顯降低，且血清孕酮、IL－8水平與正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義。由此可見，孕酮對IL－8產生抑制作用，從而減少中性粒細胞侵入蛻膜組織，可以保證妊娠的順利進行。同時，免疫組化染色和RTPCR結果顯示：在絨毛組織中，外源性給予黃體酮的自然流產小鼠IL－8的蛋白和mRNA相對含量明顯降低，與正常孕鼠比較無顯著性差異；在蛻膜組織中，外源性給予黃體酮的自然流產小鼠IL－8蛋白和mRNA相對含量也降低，并接近正常孕鼠的水平。

因此推測，孕酮通過下調IL－8表達來減少自然流產的發(fā)生和發(fā)展，此研究可為防治反復自然流產提供一定的理論依據。

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