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    蛛網(wǎng)膜下腔出血后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

    2015-03-05 06:19:08趙彥芬河南省中醫(yī)院麻醉科河南鄭州450002
    中國老年學(xué)雜志 2015年16期
    關(guān)鍵詞:凋亡

    趙 峰 趙彥芬 毛 軻(河南省中醫(yī)院麻醉科,河南 鄭州 450002)

    蛛網(wǎng)膜下腔出血后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

    趙峰趙彥芬毛軻
    (河南省中醫(yī)院麻醉科,河南鄭州450002)

    〔摘要〕目的探討蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化。方法90只小鼠隨機(jī)分為正常組12只、SAH 組48只和假手術(shù)組30只; SAH組與假手術(shù)組再隨機(jī)分為6、12、24、48 h和3、7 d 6個(gè)亞組。應(yīng)用枕大池內(nèi)的自體動(dòng)脈血二次注入法構(gòu)建起大鼠SAH模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測3組海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的caspase-3及bcl-2的表達(dá)。結(jié)果SAH組凋亡分子caspase-3和抗凋亡分子bcl-2的mRNA都不同程度地升高,caspase-3隨著時(shí)間的不斷延長而隨之增多,在24 h后這種增多更明顯,48 h后達(dá)高峰,24 h至7 d各時(shí)間段和假手術(shù)組、正常組相比差異顯著(P<0.05)。正常組與假手術(shù)組在海馬區(qū)內(nèi)的表達(dá)量各時(shí)間點(diǎn)差異不明顯(P>0.05)。Bcl-2在SAH后12 h變化最明顯,Bcl-2表達(dá)量各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組、正常組差異明顯(P<0.05)。結(jié)論SAH后早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,凋亡及抗凋亡途徑均在下丘腦內(nèi)起作用。

    〔關(guān)鍵詞〕腦損傷;凋亡;神經(jīng)細(xì)胞

    第一作者:趙峰(1970-),男,主治醫(yī)師,主要從事臨床麻醉研究。

    蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)占急性腦卒中的10%左右〔1〕。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果表明,我國SAH發(fā)病率約為2.0/10萬人年,也有學(xué)者調(diào)查認(rèn)為是每年(6~20) /10萬人〔2〕。另外,患者由于腦實(shí)質(zhì)內(nèi),腦室出血,硬膜外及硬膜下血管破裂,進(jìn)而導(dǎo)致血液穿破腦組織流入蛛網(wǎng)膜下腔,而引發(fā)的臨床綜合征,稱之為繼發(fā)性SAH。SAH典型臨床表現(xiàn)為突然發(fā)生的劇烈頭痛、惡心、嘔吐和腦膜刺激征,伴或不伴局灶體征。劇烈活動(dòng)中或活動(dòng)后出現(xiàn)爆裂性局限性或全頭部劇痛,難以忍受,呈持續(xù)性或持續(xù)進(jìn)行性加重,有時(shí)上頸段也可出現(xiàn)疼痛。其始發(fā)部位常與動(dòng)脈瘤破裂部位有關(guān)。常見伴隨癥狀有嘔吐、短暫意識(shí)障礙、項(xiàng)背部疼痛、畏光等。本實(shí)驗(yàn)分析SAH小鼠海馬組織caspase-3和Bcl-2水平和早期腦損傷關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組90只健康成年雄性小鼠,體質(zhì)量25~30 g,均由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為SAH組48只,假手術(shù)組30只,正常組12只,其中SAH組和假手術(shù)組分為6、12、24、48 h、3、7 d,共6個(gè)亞組,SAH亞組各8只。而假手術(shù)組每亞組5只。

    1.2儀器和試劑石蠟包埋機(jī)(BMJ-III,中國,常州) ; 301-268型轉(zhuǎn)輪式組織切片機(jī)Leica公司,德國;奧林巴斯生物顯微鏡BHS型,日本; SP9001免疫組化試劑盒;多克隆抗體〔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(分裝SantaCruz公司)〕;鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶,免疫組織化學(xué)檢測試劑盒及3-二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(由北京中杉金橋公司提供)。

    1.3SAH模型制作采用10%水合氯醛(規(guī)格為300 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后取仰臥位,將其固定在立體定向儀上,剪開腹部皮膚,將帶0.5 ml注射器的套管針插入左心室直達(dá)主動(dòng)脈,抽取新鮮的動(dòng)脈血,同時(shí)使用止血鉗牢牢夾緊,給予結(jié)扎止血處理,完成后再進(jìn)行逐層縫合;然后取俯臥位,將其牢牢固定在腦立體定位儀,沿著頸背部中線直至切開皮膚皮下,用無菌光滑鈍頭針頭刺破顱骨后,將0.3 ml左右新鮮動(dòng)脈血緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔,頭置低位使血液擴(kuò)散,10 min后拔除針頭,封閉骨孔,縫合切口。假手術(shù)組除向枕大池內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液0.3 ml,其余處理與上述方法相同。

    1.4海馬組織的提取及固定麻醉消毒后,SAH后不同時(shí)間段取仰臥位固定后慢慢剪開腹部皮膚,提起劍突,同時(shí)沿著胸骨左側(cè)方向剪開肋骨,暴露出心臟部位,用無菌生理鹽水(37℃)、4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注,先快后慢,灌注總量為400 ml左右。小鼠斷頭后在顯微鏡下取出腦組織迅速取出,根據(jù)鼠腦定位,仔細(xì)分離出海馬組織后,置于4%多聚甲醛中固定,4℃過夜。石蠟包埋,修塊,切片。

    1.5神經(jīng)功能檢測評(píng)分記錄各SAH組24 h死亡率,存活小鼠在實(shí)驗(yàn)完成后24 h根據(jù)Bederson〔3〕標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)內(nèi)容來實(shí)施神經(jīng)行為功能缺損評(píng)分,具體的標(biāo)準(zhǔn)主要包括:提鼠尾距離地面33 cm(1尺)左右處,如果前肢對(duì)稱伸向地面,可判定為0分;手術(shù)對(duì)側(cè)肩內(nèi)旋,同時(shí)前肢發(fā)生內(nèi)收,1分;手術(shù)對(duì)側(cè)肩內(nèi)旋,同時(shí)可見前肢內(nèi)收,推動(dòng)雙肩過程中手術(shù)對(duì)側(cè)的抵抗力開始出現(xiàn)下降,2分;手術(shù)對(duì)側(cè)肩發(fā)生內(nèi)旋,同時(shí)前肢出現(xiàn)內(nèi)收;在推動(dòng)雙肩的過程中發(fā)現(xiàn)手術(shù)對(duì)側(cè)的抵抗力開始下降;在空曠的平面上,小鼠開始進(jìn)行繞圈行走,3分;前肢發(fā)生內(nèi)收;推動(dòng)雙肩過程中手術(shù)對(duì)側(cè)的抵抗力開始發(fā)生下降;沒有出現(xiàn)任何自主活動(dòng),4分。

    1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1各SAH組24 h死亡率和神經(jīng)行為功能缺損情況SAH組后24 h,有少數(shù)動(dòng)物(神經(jīng)功能缺損評(píng)分4分14只,3分和2分各12只,1分6只,0分4只)出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙,表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)減少、反應(yīng)淡漠和拒絕進(jìn)食(P<0.05)。對(duì)照組和假手術(shù)組無明顯神經(jīng)行為異常表現(xiàn)。

    2.23組海馬區(qū)caspase-3表達(dá)水平SAH組海馬區(qū)內(nèi)caspase-3隨著時(shí)間的不斷延長而增多,24 h后其表達(dá)量的增多明顯,48 h后達(dá)高峰,24 h至7 d各時(shí)間段和假手術(shù)組、正常組差異顯著(P<0.05)。正常組與假手術(shù)組海馬區(qū)內(nèi)的caspase-3各時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(P>0.05)。見表1。SAH組caspase-3陽性顯示細(xì)胞呈棕黃色,見圖1。

    表1 各組caspase-3海馬區(qū)不同時(shí)間段平均光密度(±s)

    表1 各組caspase-3海馬區(qū)不同時(shí)間段平均光密度(±s)

    與SAH組比較: 1) P<0.05;與6、12 h比較: 2) P<005;下表同

    組別 n 6 h 12 h 24 h 48 h 3 d 7 d正常組 12  0.002 4±0.001 8  0.002 4±0.001 8  0.002 4±0.001 81)0.002 4±0.001 81) 0.002 4±0.001 81)0.002 4±0.001 81)假手術(shù)組 30  0.002 2±0.001 1  0.002 3±0.001 7  0.002 6±0.001 31)0.002 7±0.001 01) 0.002 4±0.001 21)0.002 5±0.001 41)SAH組 48  0.003 0±0.003 2  0.003 3±0.004 2  0.007 2±0.005 32) 0.009 0±0.005 12) 0.008 4±0.004 72) 0.007 8±0.003 62)

    圖1 正常組和SAH組海馬區(qū)caspase-3陽性表達(dá)(×1 000)

    2.33組Bcl-2蛋白表達(dá)SAH組12 h明顯升高,第2天時(shí)達(dá)到最高峰,直到第7天一直處于高水平。24 h至7 d各時(shí)間段和假手術(shù)組及正常組差異顯著(P<0.05)。正常組和假手術(shù)組海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)量各時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(P>0.05)。見表2。SAH組Bcl-2陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。見圖2。

    2.4SAH組2 d caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)變化SAH組第2 天caspase-3及Bcl-2蛋白和假手術(shù)組比較,表現(xiàn)出了不同程度的升高現(xiàn)象。見圖3。

    表2 各組Bcl-2蛋白海馬區(qū)表達(dá)(±s)

    表2 各組Bcl-2蛋白海馬區(qū)表達(dá)(±s)

    組別 n 6 h 12 h 24 h 48 h 3 d 7 d正常組 12  49.23±5.43 49.45±5.34 49.42±5.161) 49.26±5.751) 49.36±5.761) 49.41±5.521)假手術(shù)組 30  51.64±6.14 49.09±5.57  51.57±6.491) 50.35±7.161) 51.85±7.121) 50.36±5.221)SAH組 48  51.53±5.38 62.68±4.92 65.74±3.95 69.23±2.15 64.45±3.93 63.79±1.36

    圖2 正常組和SAH組海馬區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)(×1 000)

    圖3 SAH組48 h caspase-3和Bcl-2蛋白的變化

    3 討論

    SAH最重要危險(xiǎn)因素主要來自于導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的因素,包括高血壓、吸煙、大量飲酒、既往有動(dòng)脈瘤破裂病史、動(dòng)脈瘤體積較大、多發(fā)性動(dòng)脈瘤等〔4~6〕。與不吸煙者相比,吸煙者的動(dòng)脈瘤體積更大,且更常出現(xiàn)多發(fā)性動(dòng)脈瘤。任何年齡均可發(fā)病,青壯年更常見,動(dòng)脈瘤破裂好發(fā)于30~60歲,女性多于男性,血管畸形多見于青少年〔7,8〕。SAH突然起病,數(shù)秒鐘或數(shù)分鐘發(fā)生頭痛是最常見的起病方式?;颊叱D芮宄孛枋銎鸩〉臅r(shí)間和情景。發(fā)病前多有明顯誘因,主要包括肢體劇烈運(yùn)動(dòng)或者情緒激動(dòng)、用力較大等生理或者心理活動(dòng),其他還有咳嗽、飲酒等;部分情況下也可在安靜情況下發(fā)病〔9~11〕。約1/3患者動(dòng)脈瘤破裂前數(shù)日或數(shù)周有頭痛、惡心、嘔吐等癥狀〔12~14〕。確診SAH之后,應(yīng)盡早行腦血管造影或CT血管成像(CTA)檢查,一旦證實(shí)為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂,盡快準(zhǔn)備實(shí)施開顱夾閉手術(shù)或血管內(nèi)介入栓塞治療。SAH治療目的主要是防治再出血、血管痙攣及腦積水等并發(fā)癥,降低死亡率和致殘率。

    細(xì)胞凋亡具有復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制,多種基因被證實(shí)在早期腦損傷和遲發(fā)性血管痙攣血管壁組織中參與凋亡的發(fā)生〔15,16〕,其中包括P53、Bcl-2及Caspases等。Bcl-2則被認(rèn)為是抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的最重要基因〔17~19〕,Bcl-2首次提出是在1984年,從濾泡性淋巴細(xì)胞瘤中分離得到的癌基因,研究顯示〔20〕,Bcl-2基因?qū)δX損傷后機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞的生存發(fā)揮積極作用,應(yīng)用價(jià)值較高。caspase-3是現(xiàn)階段學(xué)界一致認(rèn)可的細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶,屬于機(jī)體多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的一個(gè)重要匯聚點(diǎn),也是細(xì)胞凋亡時(shí)的一個(gè)必經(jīng)之路,因而臨床上普遍將其當(dāng)作凋亡發(fā)生的一種標(biāo)志酶〔21,22〕。

    綜上,SAH后存在著早期腦損傷問題,同時(shí)細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致早期腦損傷發(fā)生并進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵因素之一,不排除與神經(jīng)元凋亡有關(guān),同時(shí)也可能存在其他細(xì)胞的凋亡。

    4 參考文獻(xiàn)

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    〔2014-07-09修回〕

    (編輯苑云杰)

    〔中圖分類號(hào)〕R741.02

    〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

    〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4491-03;

    doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.031

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