蛛網(wǎng)膜下腔出血后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

趙　峰　趙彥芬　毛　軻(河南省中醫(yī)院麻醉科，河南　鄭州　450002)

蛛網(wǎng)膜下腔出血后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

趙峰趙彥芬毛軻
(河南省中醫(yī)院麻醉科，河南鄭州450002)

〔摘要〕目的探討蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化。方法90只小鼠隨機(jī)分為正常組12只、SAH 組48只和假手術(shù)組30只; SAH組與假手術(shù)組再隨機(jī)分為6、12、24、48 h和3、7 d 6個亞組。應(yīng)用枕大池內(nèi)的自體動脈血二次注入法構(gòu)建起大鼠SAH模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測3組海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的caspase-3及bcl-2的表達(dá)。結(jié)果SAH組凋亡分子caspase-3和抗凋亡分子bcl-2的mRNA都不同程度地升高，caspase-3隨著時間的不斷延長而隨之增多，在24 h后這種增多更明顯，48 h后達(dá)高峰，24 h至7 d各時間段和假手術(shù)組、正常組相比差異顯著(P＜0.05)。正常組與假手術(shù)組在海馬區(qū)內(nèi)的表達(dá)量各時間點(diǎn)差異不明顯(P＞0.05)。Bcl-2在SAH后12 h變化最明顯，Bcl-2表達(dá)量各時間點(diǎn)與假手術(shù)組、正常組差異明顯(P＜0.05)。結(jié)論SAH后早期腦損傷海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，凋亡及抗凋亡途徑均在下丘腦內(nèi)起作用。

〔關(guān)鍵詞〕腦損傷;凋亡;神經(jīng)細(xì)胞

第一作者:趙峰(1970-)，男，主治醫(yī)師，主要從事臨床麻醉研究。

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)占急性腦卒中的10％左右〔1〕。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果表明，我國SAH發(fā)病率約為2.0/10萬人年，也有學(xué)者調(diào)查認(rèn)為是每年(6～20) /10萬人〔2〕。另外，患者由于腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，腦室出血，硬膜外及硬膜下血管破裂，進(jìn)而導(dǎo)致血液穿破腦組織流入蛛網(wǎng)膜下腔，而引發(fā)的臨床綜合征，稱之為繼發(fā)性SAH。SAH典型臨床表現(xiàn)為突然發(fā)生的劇烈頭痛、惡心、嘔吐和腦膜刺激征，伴或不伴局灶體征。劇烈活動中或活動后出現(xiàn)爆裂性局限性或全頭部劇痛，難以忍受，呈持續(xù)性或持續(xù)進(jìn)行性加重，有時上頸段也可出現(xiàn)疼痛。其始發(fā)部位常與動脈瘤破裂部位有關(guān)。常見伴隨癥狀有嘔吐、短暫意識障礙、項(xiàng)背部疼痛、畏光等。本實(shí)驗(yàn)分析SAH小鼠海馬組織caspase-3和Bcl-2水平和早期腦損傷關(guān)系。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物分組90只健康成年雄性小鼠，體質(zhì)量25～30 g，均由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為SAH組48只，假手術(shù)組30只，正常組12只，其中SAH組和假手術(shù)組分為6、12、24、48 h、3、7 d，共6個亞組，SAH亞組各8只。而假手術(shù)組每亞組5只。

1.2儀器和試劑石蠟包埋機(jī)(BMJ-III，中國，常州) ; 301-268型轉(zhuǎn)輪式組織切片機(jī)Leica公司，德國;奧林巴斯生物顯微鏡BHS型，日本; SP9001免疫組化試劑盒;多克隆抗體〔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(分裝SantaCruz公司)〕;鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，免疫組織化學(xué)檢測試劑盒及3-二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(由北京中杉金橋公司提供)。

1.3SAH模型制作采用10％水合氯醛(規(guī)格為300 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后取仰臥位，將其固定在立體定向儀上，剪開腹部皮膚，將帶0.5 ml注射器的套管針插入左心室直達(dá)主動脈，抽取新鮮的動脈血，同時使用止血鉗牢牢夾緊，給予結(jié)扎止血處理，完成后再進(jìn)行逐層縫合;然后取俯臥位，將其牢牢固定在腦立體定位儀，沿著頸背部中線直至切開皮膚皮下，用無菌光滑鈍頭針頭刺破顱骨后，將0.3 ml左右新鮮動脈血緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔，頭置低位使血液擴(kuò)散，10 min后拔除針頭，封閉骨孔，縫合切口。假手術(shù)組除向枕大池內(nèi)注射0.9％氯化鈉注射液0.3 ml，其余處理與上述方法相同。

1.4海馬組織的提取及固定麻醉消毒后，SAH后不同時間段取仰臥位固定后慢慢剪開腹部皮膚，提起劍突，同時沿著胸骨左側(cè)方向剪開肋骨，暴露出心臟部位，用無菌生理鹽水(37℃)、4％多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，先快后慢，灌注總量為400 ml左右。小鼠斷頭后在顯微鏡下取出腦組織迅速取出，根據(jù)鼠腦定位，仔細(xì)分離出海馬組織后，置于4％多聚甲醛中固定，4℃過夜。石蠟包埋，修塊，切片。

1.5神經(jīng)功能檢測評分記錄各SAH組24 h死亡率，存活小鼠在實(shí)驗(yàn)完成后24 h根據(jù)Bederson〔3〕標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)內(nèi)容來實(shí)施神經(jīng)行為功能缺損評分，具體的標(biāo)準(zhǔn)主要包括:提鼠尾距離地面33 cm(1尺)左右處，如果前肢對稱伸向地面，可判定為0分;手術(shù)對側(cè)肩內(nèi)旋，同時前肢發(fā)生內(nèi)收，1分;手術(shù)對側(cè)肩內(nèi)旋，同時可見前肢內(nèi)收，推動雙肩過程中手術(shù)對側(cè)的抵抗力開始出現(xiàn)下降，2分;手術(shù)對側(cè)肩發(fā)生內(nèi)旋，同時前肢出現(xiàn)內(nèi)收;在推動雙肩的過程中發(fā)現(xiàn)手術(shù)對側(cè)的抵抗力開始下降;在空曠的平面上，小鼠開始進(jìn)行繞圈行走，3分;前肢發(fā)生內(nèi)收;推動雙肩過程中手術(shù)對側(cè)的抵抗力開始發(fā)生下降;沒有出現(xiàn)任何自主活動，4分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1各SAH組24 h死亡率和神經(jīng)行為功能缺損情況SAH組后24 h，有少數(shù)動物(神經(jīng)功能缺損評分4分14只，3分和2分各12只，1分6只，0分4只)出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為運(yùn)動減少、反應(yīng)淡漠和拒絕進(jìn)食(P＜0.05)。對照組和假手術(shù)組無明顯神經(jīng)行為異常表現(xiàn)。

2.23組海馬區(qū)caspase-3表達(dá)水平SAH組海馬區(qū)內(nèi)caspase-3隨著時間的不斷延長而增多，24 h后其表達(dá)量的增多明顯，48 h后達(dá)高峰，24 h至7 d各時間段和假手術(shù)組、正常組差異顯著(P＜0.05)。正常組與假手術(shù)組海馬區(qū)內(nèi)的caspase-3各時間點(diǎn)差異不顯著(P＞0.05)。見表1。SAH組caspase-3陽性顯示細(xì)胞呈棕黃色，見圖1。

表1　各組caspase-3海馬區(qū)不同時間段平均光密度(±s)

表1　各組caspase-3海馬區(qū)不同時間段平均光密度(±s)

與SAH組比較: 1) P＜0.05;與6、12 h比較: 2) P＜005;下表同

組別　n　6 h　12 h　24 h　48 h　3 d　7 d正常組　12　 0.002 4±0.001 8　 0.002 4±0.001 8　 0.002 4±0.001 81)0.002 4±0.001 81)　0.002 4±0.001 81)0.002 4±0.001 81)假手術(shù)組　30　 0.002 2±0.001 1　 0.002 3±0.001 7　 0.002 6±0.001 31)0.002 7±0.001 01)　0.002 4±0.001 21)0.002 5±0.001 41)SAH組　48　 0.003 0±0.003 2　 0.003 3±0.004 2　 0.007 2±0.005 32)　0.009 0±0.005 12)　0.008 4±0.004 72)　0.007 8±0.003 62)

圖1　正常組和SAH組海馬區(qū)caspase-3陽性表達(dá)(×1 000)

2.33組Bcl-2蛋白表達(dá)SAH組12 h明顯升高，第2天時達(dá)到最高峰，直到第7天一直處于高水平。24 h至7 d各時間段和假手術(shù)組及正常組差異顯著(P＜0.05)。正常組和假手術(shù)組海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)量各時間點(diǎn)差異不顯著(P＞0.05)。見表2。SAH組Bcl-2陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。見圖2。

2.4SAH組2 d caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)變化SAH組第2 天caspase-3及Bcl-2蛋白和假手術(shù)組比較，表現(xiàn)出了不同程度的升高現(xiàn)象。見圖3。

表2　各組Bcl-2蛋白海馬區(qū)表達(dá)(±s)

表2　各組Bcl-2蛋白海馬區(qū)表達(dá)(±s)

組別　n　6 h　12 h　24 h　48 h　3 d　7 d正常組　12　 49.23±5.43　49.45±5.34　49.42±5.161)　49.26±5.751)　49.36±5.761)　49.41±5.521)假手術(shù)組　30　 51.64±6.14　49.09±5.57　 51.57±6.491)　50.35±7.161)　51.85±7.121)　50.36±5.221)SAH組　48　 51.53±5.38　62.68±4.92　65.74±3.95　69.23±2.15　64.45±3.93　63.79±1.36

圖2　正常組和SAH組海馬區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)(×1 000)

圖3　SAH組48 h caspase-3和Bcl-2蛋白的變化

3　討論

SAH最重要危險(xiǎn)因素主要來自于導(dǎo)致顱內(nèi)動脈瘤破裂的因素，包括高血壓、吸煙、大量飲酒、既往有動脈瘤破裂病史、動脈瘤體積較大、多發(fā)性動脈瘤等〔4～6〕。與不吸煙者相比，吸煙者的動脈瘤體積更大，且更常出現(xiàn)多發(fā)性動脈瘤。任何年齡均可發(fā)病，青壯年更常見，動脈瘤破裂好發(fā)于30～60歲，女性多于男性，血管畸形多見于青少年〔7，8〕。SAH突然起病，數(shù)秒鐘或數(shù)分鐘發(fā)生頭痛是最常見的起病方式。患者常能清楚地描述起病的時間和情景。發(fā)病前多有明顯誘因，主要包括肢體劇烈運(yùn)動或者情緒激動、用力較大等生理或者心理活動，其他還有咳嗽、飲酒等;部分情況下也可在安靜情況下發(fā)病〔9～11〕。約1/3患者動脈瘤破裂前數(shù)日或數(shù)周有頭痛、惡心、嘔吐等癥狀〔12～14〕。確診SAH之后，應(yīng)盡早行腦血管造影或CT血管成像(CTA)檢查，一旦證實(shí)為顱內(nèi)動脈瘤破裂，盡快準(zhǔn)備實(shí)施開顱夾閉手術(shù)或血管內(nèi)介入栓塞治療。SAH治療目的主要是防治再出血、血管痙攣及腦積水等并發(fā)癥，降低死亡率和致殘率。

細(xì)胞凋亡具有復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，多種基因被證實(shí)在早期腦損傷和遲發(fā)性血管痙攣血管壁組織中參與凋亡的發(fā)生〔15，16〕，其中包括P53、Bcl-2及Caspases等。Bcl-2則被認(rèn)為是抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的最重要基因〔17～19〕，Bcl-2首次提出是在1984年，從濾泡性淋巴細(xì)胞瘤中分離得到的癌基因，研究顯示〔20〕，Bcl-2基因?qū)δX損傷后機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞的生存發(fā)揮積極作用，應(yīng)用價值較高。caspase-3是現(xiàn)階段學(xué)界一致認(rèn)可的細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，屬于機(jī)體多種凋亡刺激信號傳遞的一個重要匯聚點(diǎn)，也是細(xì)胞凋亡時的一個必經(jīng)之路，因而臨床上普遍將其當(dāng)作凋亡發(fā)生的一種標(biāo)志酶〔21，22〕。

綜上，SAH后存在著早期腦損傷問題，同時細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致早期腦損傷發(fā)生并進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，不排除與神經(jīng)元凋亡有關(guān)，同時也可能存在其他細(xì)胞的凋亡。

4　參考文獻(xiàn)

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〔2014-07-09修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R741.02

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4491-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.031