CD133在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及其意義

吳　劍　周曉紅　李真華　葛家華

CD133在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及其意義

吳劍周曉紅李真華葛家華

[摘要]目的檢測(cè)CD133在人涎腺腺樣囊性癌組織中的表達(dá)水平，探討其表達(dá)水平與腺樣囊性癌生物學(xué)行為的關(guān)系。方法收集人涎腺腺樣囊性癌石蠟標(biāo)本25例，人口腔鱗狀細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本23例為陽性對(duì)照組，腮腺正常組織標(biāo)本11例為陰性對(duì)照組，免疫組化方法檢測(cè)3組樣本中CD133的表達(dá)水平，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析CD133的表達(dá)與腺樣囊性癌發(fā)病及生物學(xué)行為之間的關(guān)系。結(jié)果CD133在人涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)較正常腮腺組織明顯增高，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中沒有表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CD133的高表達(dá)可能與人涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]CD133；腺樣囊性癌；免疫組織化學(xué)

作者單位： 400030重慶市腫瘤醫(yī)院

近年研究發(fā)現(xiàn)CD133在多種腫瘤中表達(dá)，如：白血病[1]、腦腫瘤[2]、肺癌[3]、前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、惡性黑色素瘤[6]、結(jié)腸癌[7]等，可能跟這些腫瘤的侵襲能力、免疫逃逸、耐藥性等有關(guān)。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)分析CD133在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，初步研究其表達(dá)水平與臨床分期及腫瘤進(jìn)展之間的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1標(biāo)本收集人涎腺腺樣囊性癌石蠟標(biāo)本共25例，均為2003年1月至2008年12月四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科收治的患者，所有患者均確診為涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)，均接受原發(fā)灶擴(kuò)大切除術(shù)，未進(jìn)行非手術(shù)治療(化療、放療、熱療或基因治療)。其中男性13例，女性12例，年齡28～77歲，平均48歲，腫瘤均位于腮腺內(nèi)。T1期4例，T2期6例，T3期10例，T4期5例(UICC[8,9]TNM分期)。每位患者的臨床數(shù)據(jù)包括年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)等，參照WHO的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。選取22例口腔鱗狀細(xì)胞癌和11例正常腮腺組織作為陽性和陰性對(duì)照。

1.2主要試劑兔抗人CD133多克隆抗體采用Abcam生產(chǎn)的rabbit polyclonal to CD133，CD133 抗體濃度為1 ∶100。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟如下按照免疫組化SP法操作：載玻片防脫水劑處理后，切片常規(guī)脫蠟及水化，枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)，滴加CD133 (1 ∶100)過夜，滴加二抗帶生物素的山羊抗兔IgG，DAB試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染顯微鏡觀察。

1.4結(jié)果評(píng)價(jià)CD133蛋白的陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，位于胞膜和胞漿。根據(jù)Alazawi等[10]的描述設(shè)計(jì)一個(gè)半定量的分級(jí)評(píng)分系統(tǒng)，用于評(píng)估組織塊中CD133蛋白的表達(dá)。評(píng)分系統(tǒng)依據(jù)如下，0：整個(gè)組織塊中未見到染色；Ⅰ：少量膜染色；Ⅱ：片狀非細(xì)胞膜染色；Ⅲ：細(xì)胞外周染色占組織的1/3；Ⅳ：細(xì)胞外周染色占組織的2/3；Ⅴ：細(xì)胞外周染色遍布整個(gè)上皮。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將所得數(shù)據(jù)輸入SPASS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料用例或率表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組化檢測(cè)結(jié)果正常腮腺組織中有少量的CD133的表達(dá)，主要分布在導(dǎo)管的管壁上，而CD133在腺泡和其他組織中的陽性染色較少。在涎腺腺樣囊性癌中CD133的表達(dá)明顯比另外兩個(gè)對(duì)照組增多，呈團(tuán)塊狀聚集。而人口腔鱗狀細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本中未檢測(cè)到CD133蛋白的表達(dá)。見圖1、2。

2.2臨床數(shù)據(jù)與免疫組化結(jié)果腫瘤的組織學(xué)分級(jí)與CD133的表達(dá)水平有關(guān)(r=0.354，P<0.05)，即與腫瘤的增殖和分化、分期有關(guān)，但CD133與腫瘤發(fā)病的年齡、性別、是否有周圍神經(jīng)侵襲等無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

3討論

1997年 Miraglia等[1]發(fā)現(xiàn)了一種新的造血干(祖)細(xì)胞表面標(biāo)志AC133蛋白，該蛋白在第七屆國(guó)際白細(xì)胞分化抗原工作組會(huì)議上被正式命名為CD133，并認(rèn)為是多種干(祖)細(xì)胞的表面標(biāo)志之一。CD133作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志在許多實(shí)體腫瘤中已經(jīng)被證實(shí)，包括直腸癌[7]、胰腺癌[5]、 肝癌[11]、腦惡性膠質(zhì)瘤[12]、肺癌[3]和前列腺癌[4]及惡性黑色素瘤[6]等，其中也包含頭頸部的腫瘤，如：喉癌[13]，但是在涎腺腺樣囊性癌中的研究未見報(bào)道。最近研究發(fā)現(xiàn)，CD133與腫瘤的多方面生物學(xué)特性相關(guān)，可能在這些方面對(duì)腫瘤起著調(diào)控作用，例如：CD133參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]，CD133參與細(xì)胞的免疫逃逸[14]，CD133 參與細(xì)胞的藥物耐受[15]，CD133還參與了腫瘤的放療抵抗[16]等。

表1　CD133免疫組化評(píng)分和臨床參數(shù)之間的聯(lián)系(例)

注：與同項(xiàng)目比較，△P>0.05；與同項(xiàng)目比較，*P<0.05

腺樣囊性癌是涎腺中最常見的惡性腫瘤之一，在小涎腺中發(fā)病率較高，腫瘤易沿血循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%，易侵犯神經(jīng)，沿神經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少見，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～50%，其高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率是患者死亡的主要因素，而腫瘤易侵犯神經(jīng)并沿神經(jīng)擴(kuò)散是其復(fù)發(fā)的重要因素，也是涎腺腺樣囊性癌重要特性之一。目前，研究認(rèn)為腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲性的主要機(jī)制是：腫瘤組織的施萬(Schwann)細(xì)胞分化[17,18]，導(dǎo)致了其嗜神經(jīng)的特性及侵犯神經(jīng)并沿著神經(jīng)轉(zhuǎn)移的能力；除了腫瘤的施萬細(xì)胞分化外，還有一些神經(jīng)介質(zhì)也參與了腫瘤侵犯神經(jīng)的過程，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子[19-21]等。

研究發(fā)現(xiàn)，具有較高的周圍神經(jīng)侵襲能力的實(shí)體瘤還包括以下幾種：直腸癌[7]、胰腺癌[5]、 肝癌[11]、惡性黑色素瘤[6]等。那么他們之間有什么共同的機(jī)制么？根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)CD133均在這類腫瘤中高表達(dá)，并作為重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，那么CD133在這類腫瘤中肯定扮演著重要的角色。既然，CD133作為神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物早已明確，根據(jù)干細(xì)胞的特性，神經(jīng)腫瘤干細(xì)胞在一定條件下能分化出相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞及神經(jīng)介質(zhì)，如施萬細(xì)胞，以及神經(jīng)生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子等。結(jié)合目前對(duì)腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲性的機(jī)制的研究，我們推論這類腫瘤的嗜神經(jīng)侵襲特性可能與CD133有關(guān)，但是這種關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化的方式證明了腺樣囊性癌中有CD133的高表達(dá)，而正常組織中CD133的表達(dá)量較少，可以初步認(rèn)為CD133與腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但是，本實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)一步揭示CD133與腺樣囊性癌神經(jīng)侵襲之間的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，CD133只在內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)[22]，在成熟內(nèi)皮細(xì)胞上不表達(dá)[23]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，涎腺組織是由潤(rùn)管細(xì)胞等不成熟的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)展而來的，本實(shí)驗(yàn)中CD133在這些導(dǎo)管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，與該觀點(diǎn)符合。在正常的涎腺組織中有少量CD133的表達(dá)，基本上都位于導(dǎo)管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，其余部位無表達(dá)，而鱗狀細(xì)胞癌中沒有表達(dá)也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一理論。

CD133與腫瘤的增殖和分化有關(guān)，CD133的表達(dá)水平越高，腫瘤組織的分化越差，惡性程度越高，分期越晚，與大多數(shù)研究的觀點(diǎn)一致[24]，但是CD133表達(dá)水平與患者的發(fā)病年齡、性別、原發(fā)灶大小、神經(jīng)浸潤(rùn)等均無明顯關(guān)聯(lián)。

本實(shí)驗(yàn)中CD133的表達(dá)水平在嗜神經(jīng)組和非嗜神經(jīng)組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在周圍神經(jīng)侵襲陽性組中，CD133的表達(dá)水平與腺樣囊性癌的嗜神經(jīng)侵襲能力及分期有關(guān)，隨著CD133表達(dá)的增加，腫瘤發(fā)生神經(jīng)侵襲的程度增加。但是，我們的實(shí)驗(yàn)樣本含量相對(duì)較小，沒有繼續(xù)對(duì)CD133表達(dá)水平與神經(jīng)侵襲之間的關(guān)系進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，所以這種關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中僅涉及顯微鏡下病理標(biāo)本中的神經(jīng)是否受到侵襲、侵襲程度如何，以及病史記錄中有無神經(jīng)癥狀等的回顧性研究，樣本選擇的偏倚性大，可靠的結(jié)論仍需要大量的實(shí)驗(yàn)支撐，需要建立可靠的動(dòng)物模型以及定量實(shí)驗(yàn)等才能得出進(jìn)一步的數(shù)據(jù)，以證明CD133與神經(jīng)侵襲的相關(guān)性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)從免疫組化的角度揭示了CD133在腺樣囊性癌中的表達(dá)相對(duì)于正常組織明顯升高，其高表達(dá)可能與腫瘤的增殖和分化有關(guān)，與患者的發(fā)病年齡、性別、原發(fā)灶大小等均無明顯關(guān)聯(lián)， CD133可能與腺樣囊性癌的嗜神經(jīng)侵襲特性有關(guān)。因此，CD133可能是一個(gè)較好的研究涎腺腺樣囊性癌的分子標(biāo)志。

參考文獻(xiàn)

[1]Miraglia S,Godfrey W,Yin AH,et al.A novel five-transmembrane hematopoietic stem cell antigen:isolation characterization and molecular loning[J].Blood,1997,90(12):5013-5021.

[2]Singh SK,Clarke ID,Terasaki M,et al.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors[J].Cancer Res,2003,63(18):5821-5828.

[3]Kim CF,Jackson EL,Woolfenden AE,et al.Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer[J].Cell,2005,121(6):823-835.

[4]Collins AT, Berry PA, Hyde C,et al.Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells[J].Cancer Res,2005,65(23):10946-10951.

[5]Hermann PC,Huber SL,Herrler T,et al.Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer[J].Cell Stem Cell, 2007,1(3):313-323.

[6]Monzani E,Facchetti F,Galmozzi E,et al.Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential[J].Eur J Cancer,2007,43(5):935-946.

[7]O'Brien CA,Pollett A,Gallinger S,et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J].Nature,2007,445(7123):106-110.

[8]Takes RP,Rinaldo A,Silver CE,et al.Future of the TNM classification and staging system in head and neck cancer[J].Head Neck,2010, 32(12):1693-1711.

[9]LH H,Wittekind CH.TNM classification of malignant tumour [M]. 6th .Newyork:Wiley-Liss,2002:33-34.

[10] Alazawi WO,Morris LS,Stanley MA,et al.Altered expression of desmosomal components in high-grade squamous intraepithelial lesions of the cervix[J].Virchows Arch,2003, 443(1):51-56.

[11] Suetsugu A,Nagaki M,Aoki H,et al.Characterization of CD133+ hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,351(4):820-824.

[12] Clement V, Sanchez P,de Tribolet N,et al.HEDGEHOG-GLI1 signaling regulates human glioma growth cancer stem cell self-renewal and tumorigenicity[J].Curr Biol,2007,17(2):165-172.

[13] 衛(wèi)旭東.人喉癌Hep-2細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞的識(shí)別與鑒定[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2007.

[14] Wu A,Wiesner S,Xiao J,et al.Expression of MHC I and NK ligands on human CD133+glioma cells:possible targets of immunotherapy[J].J Neurooncol,2007,83(2):121-131.

[15] Liu G,Yuan X,Zeng Z,et al.Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+cancer stem cells in glioblastoma[J].Mol Cancer,2006,67(5):1-12.

[16] Bao S,Wu Q,McLendon RE,et al.Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J].Nature,2006,444(7120):756-760.

[17] Toth AA,Daley TD, Lampe HB,et al.Schwann cell differentiation of modified myoepithelial cells within adenoid cystic carcinomas and polymorphous low-grade adenocarcinomas:clinicopathologic assessment of immunohistochemical staining[J].J Otolaryngol,1996,25(2):94-102.

[18] 羅小龍,孫沫逸,楊連甲，等. 雪旺細(xì)胞標(biāo)志物S100蛋白在涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲中的意義[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2003,19(2):173-175。

[19] Iwahashi N,Nagasaka T,Tezel G,et al.Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor correlates with perineural invasion of bile duct carcinoma[J].Cancer,2002,94(1): 167-174.

[20] Shang J,Sheng L,Wang K,et al.Expression of neural cell adhesion molecule in salivary adenoid cystic carcinoma and its correlation with perineural invasion[J].Oncol Rep,2007,18(6):1413-1416.

[21] 余立強(qiáng),張魯囡,孫沫逸.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)雪旺氏細(xì)胞趨化移動(dòng)的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2009,7 (4):203-205。

[22] Yin AH,Miraglia S,Zanjani ED,et al.AC133—a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells[J].Blood,1997,90(12):5002-5012.

[23] Peichev M,Naiyer AJ,Pereira D,et al.Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors[J].Blood,2000,95(3):952-958.

[24] 熊漢真,楊敏,楊朝暉，等.CD133+臍血干細(xì)胞對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng) 黏附及遷移的影響[J].中國(guó)癌癥雜志, 2008,18(4):241-244.

(2014-11-18收稿2015-01-21修回)

Expression of CD133 in adenoid cystic carcinoma and mechanism

WuJian,ZhouXiaohong,LiZhenhua,etal

ChongqingCancerHospital,Chongqing400030,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of CD133 in human adenoid cystic carcinoma，and explore the potential role and mechanism of CD133 in the progress of adenoid cystic carcinoma．MethodsTwenty-five paraffin cases of human adenoid cystic carcinoma tissues and 23 cases of human oral squamous cell carcinoma tissues and 11 fresh cases of normal salivary gland tissue were collected, and CD133 expression level in these three groups were detected using immunohistochemistry, then the relationship between CD133 expression and various clinical parameters was analyzed. ResultsAn obvious higher CD133 protein expression in salivary gland adenoid cystic carcinoma was detected while it was not found in oral squamous cell carcinoma, and its expression level was related to tumor proliferation and differentiation. The difference was statistically significant. ConclusionCD133 may play an important role in the generation and development of human salivary adenoid cystic carcinoma.

[Key words]CD133；Adenoid cystic carcinoma；Immunohistochemistry

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.04.003