西格列汀對2型糖尿病鼠血清及不同組織視黃醇結合蛋白4的影響

戚仁娟　胡紅琳　夏　莉　劉炯炯　王長江　方朝暉

·基礎醫(yī)學·

西格列汀對2型糖尿病鼠血清及不同組織視黃醇結合蛋白4的影響

戚仁娟胡紅琳夏莉劉炯炯王長江方朝暉

[摘要]目的研究西格列汀對2型糖尿病大鼠血清及不同組織視黃醇結合蛋白4(RBP4)表達水平的影響。方法將35只SD大鼠隨機分為兩組，即對照組(NC，n=10)和高脂組(HF，n=25)。12周后，HF組大鼠腹腔一次性注射鏈脲佐菌素35 mg/kg，成功建立2型糖尿病模型大鼠20只，并隨機分為糖尿病對照組(DM組，n=10)和西格列汀干預組(SP組，n=10)。分別測定干預前后體質量(BW)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)及血清RBP4水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島β細胞功能指數(shù)(HOMA-β)。Western Blot法檢測大鼠不同組織RBP4蛋白表達水平。結果①與NC組相比，DM組、SP組BW、FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOM A-IR、RBP4升高，HOMA-β降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；西格列汀干預后，SP組較DM組FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR、RBP4降低，HOMA-β升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。② 與NC組相比，DM組附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，SP組附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。結論2型糖尿病大鼠血清RBP4水平升高，附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達水平增高。西格列汀能顯著降低2型糖尿病大鼠血清RBP4水平及附睪脂肪、肌肉組織中RBP4蛋白表達水平。

[關鍵詞]2型糖尿病；西格列??；視黃醇結合蛋白4

作者單位： 230022合肥安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科(戚仁娟，胡紅琳，夏莉，劉炯炯，王長江)

230031合肥安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院內分泌科(方朝暉)

2型糖尿病是世界范圍內嚴重的公共衛(wèi)生問題，嚴重危害民眾健康，消耗大量社會資源之一。據(jù)估計，全球目前約有2.85億2型糖尿病患者，且這個數(shù)字仍在不斷增長[1]。2型糖尿病患者中80%為超重或肥胖，肥胖是胰島素抵抗和高血糖的主要發(fā)病因素。視黃醇結合蛋白4(RBP4)是近年發(fā)現(xiàn)的由白色脂肪組織特異分泌的細胞因子，其在糖調節(jié)受損、糖尿病患者中明顯高于健康對照組，并且隨著病情進展血清RBP4進一步升高。RBP4作為新的脂肪因子，具有引起胰島素抵抗(IR)的作用，參與一系列與IR相關的疾病，包括糖尿病、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[2]。

西格列汀作為二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，具有刺激胰島β細胞再生，促進胰島素分泌，抑制內源性葡萄糖的生成，達到降低血糖的作用，但西格列汀與2型糖尿病患者的RBP4的相關研究較少。本實驗通過建立高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠模型，給予西格列汀干預，測定2型糖尿病大鼠干預前后血清RBP4水平及肝臟組織、附睪脂肪及肌肉組織RBP4蛋白的表達水平，分析西格列汀干預對RBP4的可能作用及作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及飼料35只普通級4周齡雄性SD大鼠，體質量(100±20)g，購自安徽醫(yī)科大學動物實驗中心。普通飼料由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心配制，為國家標準齲齒類動物固體混合飼料。高脂飼料配方為普通飼料55%，豬油12%，蔗糖5%，奶粉8%，花生5%，雞蛋10%，麻油3%，食鹽2%。

1.2實驗試劑西格列汀(默沙東公司)，胰島素放免試劑盒(北京原子高科公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，RBP4酶免試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)，穩(wěn)豪血糖儀及試紙(美國強生公司)，RBP4一抗(英國Abcam公司)，RBP4二抗、β-actin一抗、β-actin二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3動物分組及2型糖尿病大鼠模型建立將35只大鼠予以普通飼料適應性喂養(yǎng)1 周后隨機分為對照組(NC組,n=10)，予普通飼料喂養(yǎng)；高脂飼料組(HF組，n=25)，予高脂飼料喂養(yǎng)。兩組大鼠平行飼養(yǎng)，自由飲水，室溫21~24℃，相對濕度40%~60%，自然晝夜節(jié)律，2周稱體質量1次。12周后，將HF組的大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用前溶解在pH=4.5的0.1 mmo/L檸檬酸緩沖液中)35 mg/kg，于注射后第7天內眥靜脈取血測大鼠血糖，將空腹血糖大于11.1 mmol/L者定為糖尿病模型造模成功(n=20)[3]，并將其隨機分為西格列汀組(SP組，n=10)和糖尿病對照組(DM組，n=10)。

1.4干預方法SP組給予西格列汀灌胃10 mg·kg-1·d-1，NC組及DM組均以等劑量生理鹽水灌胃，共干預6周，干預期間NC組繼續(xù)普通飲食，DM組及SP組繼續(xù)高脂飲食。

1.5標本采集及檢測糖尿病模型造模成功后，所有大鼠禁食12 h，內眥靜脈取血2 mL，干預6周后，所有大鼠禁食12 h，稱體質量，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血3 mL，血標本靜止15 min后，3 200 r/min離心10 min，留取血清置于-80 ℃冰箱保存。麻醉狀態(tài)下解剖大鼠，冰上操作取出肝臟組織、附睪脂肪及肌肉組織，置于液氮罐中以備提取蛋白質。血糖儀紙片法測定血糖，Roche Modular全自動生化分析儀測定血脂，放免法測定胰島素，ELISA法測定血清RBP4，采用HOMA-IR模型公式計算胰島素抵抗指數(shù)[HOMA-IR=FINS(mIU/L)×FBG(mmol/L)/22.5]，胰島β細胞功能指數(shù)(HOMO-β)表示胰島β細胞功能強度[HOMO-β=20×FINS/(FBG-3.5)][4]。

1.6Western Blot提取肝臟組織中的總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量。依次進行電泳、轉膜、封閉，RBP4兔抗一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜后，辣根酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶4 000)室溫下孵育2 h。充分洗滌后加入ECL化學發(fā)光劑，暗室顯影成像。檢測后的膜重新用TBST清洗3次，TBS清洗1次(10 min/次)，重復上述步驟進行內參照β-actin(一抗1 ∶1 000稀釋，二抗1 ∶4 000稀釋)的結合。采用上述相同方法，在相同條件下完成附睪脂肪、肌肉組織RBP4及對應的β-actin蛋白檢測。RBP4蛋白相對表達量以其特異性結合條帶與β-actin結合條帶的灰度值比值表示。

2結果

2.1干預前各組大鼠代謝指標比較與NC組相比，DM組、SP組大鼠體質量(BW)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)升高，胰島β細胞功能指數(shù)(HOMA-β)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，DM組、SP組兩組間各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

±s)

注：與NC組比較：*P<0.05

2.2干預后各組大鼠代謝指標比較西格列汀干預6周后，SP組大鼠的FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR下降，HOMA-β升高，與DM組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。西格列汀干預后，與DM組相比，SP組大鼠體質量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

±s)

注：與NC組比較，*P<0.05；與DM組相比，#P<0.05

2.3干預前后各組大鼠血清RBP4水平比較干預前，DM、SP組大鼠血清RBP4水平升高，與NC組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，DM組、SP組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義。西格列汀干預后SP組血清RBP4水平下降，與干預前相比，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，與DM組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，但仍高于NC組(P<0.05)。詳見表3。

±s)

注：與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

2.4Western Blot結果

2.4.1肝臟組織中RBP4蛋白的表達與NC組相比，DM組RBP4蛋白表達水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；與DM組相比，SP組RBP4蛋白表達水平有降低趨勢，但差異亦無統(tǒng)計學意義。見圖1(A、D)。

2.4.2附睪脂肪RBP4蛋白的表達與NC組相比，DM組RBP4蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，SP組RBP4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1(B、D)。

2.4.3肌肉組織RBP4蛋白的表達與NC組相比，DM組RBP4蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，SP組RBP4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1(C、D)。

A：肝臟組織中RBP4蛋白的表達；B：附睪脂肪中RBP4蛋白的表達；C：肌肉組織中RBP4蛋白的表達；D：不同組織中RBP4蛋白表達水平的統(tǒng)計學分析，與NC組比較，*P<0.05，與DM組相比，#P<0.05

3討論

RBP4是新近被發(fā)現(xiàn)的作用于肌肉和肝臟，并影響胰島素敏感性的脂肪因子。RBP4主要由肝臟、脂肪及肌肉組織合成，它可以將視黃醇從肝臟轉運至各種靶組織[5]。當RBP4在脂肪組織表達過多時可導致葡萄糖轉運體-4(GLUT-4)表達下降，抑制肝臟和肌肉組織對葡萄糖的利用[6]。RBP4水平的升高與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關，RBP4導致胰島素抵抗的機制為RBP4水平升高可使肝臟產生過多的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PECK)，導致糖異生增加，并且通過IRS-1和PI3K等途經導致肌肉組織胰島素信號傳導減弱[2, 7, 8]。減輕體質量及鍛煉能夠降低2型糖尿病患者中的RBP4水平，RBP4水平的降低與胰島素抵抗的改善密切相關[8]。降低RBP4水平也許能夠成為治療2型糖尿病的一種新方法[4]。

本實驗結果顯示，2型糖尿病大鼠血清RBP4水平及附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達水平較正常對照組升高，且以附睪脂肪RBP4蛋白表達水平增高為主，肝臟組織中RBP4表達量較正常對照組無明顯改變，這提示RBP4雖然主要由肝臟、脂肪和肌肉組織合成，但在高血糖狀態(tài)下，血清中增高的RBP4水平可能主要來源于脂肪組織。

目前，關于西格列汀對2型糖尿病大鼠RBP4蛋白表達有無影響的相關報道較少。本實驗通過給予2型糖尿病大鼠西格列汀干預6周來觀察RBP4蛋白表達水平的變化，實驗結果表明西格列汀干預后，血清RBP4水平及附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達水平下降，且糖脂代謝明顯改善，與Derosa等[4]在2型糖尿病患者中的研究結果類似。西格列汀降低RBP4蛋白表達水平的機制目前尚不完全明確，可能因為降低了空腹血糖和胰島素，改善胰島素抵抗，RBP4適應性下調。另有研究[9]表明，GLP-1干預后糖尿病模型鼠脂肪組織GLUT4表達水平增加，而RBP4水平與GLUT4水平呈負相關[10]，隨著GLUT4表達水平增加，RBP4表達水平下降。因此推測，西格列汀干預后RBP4表達水平下調與體內GLP-1濃度增加，GLUT-4表達水平增加亦有關。經西格列汀干預后，SP組大鼠體質量雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，與Hemmeryck等[11]在糖尿病鼠中的研究結果一致，原因可能為西格列汀干預過程中繼續(xù)高脂飲食，且西格列汀并未影響大鼠的食物攝入量，抑或與干預時間有關。

綜上所述，2型糖尿病大鼠血清及附睪脂肪、肌肉組織中RBP4水平升高，RBP4在肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。西格列汀干預后能顯著降低2型糖尿病大鼠血清及脂肪組織、肌肉組織RBP4表達水平。

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(2014-11-08收稿2015-01-07修回)

Effects of sitagliptin on serum and different tissues retinol binding protein 4 expression levels in a rat model of type 2 diabetes

mellitus

QiRenjuan,HuHonglin,XiaLi,etal

DepartmentofEndocrinology，theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022，China

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effects of sitagliptin on metabolic parameters, serum retinol binding protein 4 (RBP4) levels, liver, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 expression levels in a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM). MethodsTirty-five Sprague Dawley rats were randomly divided into normal diet group (NC group) of 10 rats and high fat diet group (HF group) of the remaining 25. After being fed on a high fat diet for 12 weeks, the HF group was given the peritoneal injection of a low dose of streptozotocin 35 mg/kg, and a rat model of T2DM (n=20) was established and randomly divided into two groups: diabetic control group (DM group,n=10), sitagliptin group (SP group,n=10). Body weight (BW), fasting blood glucose (FBG), triglyceride (TG), total cholesterol (TCH), low-density lipoprotein (LDL-C), fasting insulin (FINS), serum RBP4 were measured respectively before and after the 6 weeks of treatment, and homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IR), homeostasis model assessment β-cell function index (HOMA-β) were calculated. The liver, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels were detected by Western blot. Results①The levels of BW, FBG, TG, TCH, LDL-C, FINS, HOMA-IR and serum RBP4 in DM group and SP group increased while the levels of HOMA-β decreased compared with those of NC group with a statistical significance (P<0.05). After treatment with sitagliptin, the levels of FBG, TG, TCH, LDL-C, FINS, HOMA-IR and serum RBP4 of SP group decreased while the levels of HOMA-β increased compared with those of DM group with a statistical significance (P<0.05). ② Epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels in DM group increased compared with those in NC group, and epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels in SP group decreased compared with those in DM group. ConclusionSerum, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein levels are elevated in a rat model of T2DM. Sitagliptin can lower serum, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein levels in a rat model of T2DM.

[Key words]Type 2 diabetes mellitus; Sitagliptin; Retinol binding protein 4

通信作者：胡紅琳，hhlin1994@sina.com

基金項目：安徽中醫(yī)學院中醫(yī)藥管理局重點學科—中醫(yī)內分泌學科開放基金(2011nfmxk004)；安徽省高校省級自然科學研究項目(KJ2013Z126)；安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2011年度國家自然科學基金青年科學基金培養(yǎng)計劃(2011KJ11)

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.04.001