GSTP1基因變異與胃黏膜非典型增生的關(guān)系

王旭光，張　忠，張　珉，王　瑩

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽(yáng) 110034)

GSTP1基因變異與胃黏膜非典型增生的關(guān)系

王旭光※，張忠，張珉，王瑩

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽(yáng) 110034)

胃黏膜非典型增生(gastric dysplasia，GD)是胃癌的一種重要的癌前病變，但并不是所有的GD都發(fā)展為胃癌，如何確定可癌變的GD尤為重要。目前，篩查基因的多態(tài)性已成為確定某種疾病高危人群的重要方法之一。關(guān)于基因多態(tài)性與胃癌關(guān)系的報(bào)道逐年增多，其中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶類(glutathione S-transferases，GSTs)與胃癌的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)之一[1]，特別是GSTP1(GST P 1，GSTP1)基因第5外顯子1587對(duì)堿基處A→G，導(dǎo)致異亮氨酸-105→纈氨酸，其與乳腺癌、口腔癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及肺癌等多種腫瘤有關(guān)[2-5]。前期的研究已證實(shí)，GSTP1第5外顯子的多態(tài)性與胃癌有關(guān)[6]。本研究在此基礎(chǔ)上擬檢測(cè)GSTP1在GD中的變異規(guī)律，以期篩選出高危GD患者，并予以干預(yù)治療。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2008年3月至2012年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、沈陽(yáng)奉天醫(yī)院以及沈陽(yáng)第四人民醫(yī)院收治的150例胃部疾病患者為研究對(duì)象，其中男83 例、女67例，年齡28～85歲，平均(51±11)歲。其中，經(jīng)病理確診的胃癌患者50例(胃癌組)，男24例、女26例，年齡48～85歲，平均(52±3)歲。非萎縮性胃炎患者50例(非萎縮性胃炎組)，男28例、女22例，年齡28～75歲，平均(50±12)歲。GD患者50例(GD組)男31例、女19例，年齡35～80歲，平均(51±7)歲，依據(jù)文獻(xiàn)[7]再進(jìn)一步將GD患者分為低GD組(27 例)：男16例、女11例，年齡35～75歲，平均(50±7)歲；高度GD組(23 例)：男15例、女8例，年齡40～80歲，平均(52±6)歲。各組患者的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患者知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2遺傳平衡檢測(cè)為了檢驗(yàn)本組人群 GSTP1基因型頻率是否具有群體代表性，對(duì)人群的基因型頻率進(jìn)行遺傳平衡檢測(cè)。結(jié)果表明，實(shí)際值和期望值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.263,P>0.05)，說(shuō)明GSTP1各基因型分布頻率已達(dá)到Hardy-Werberg遺傳平衡，具有群體代表性。

1.3標(biāo)本采集非萎縮性胃炎組和GD組患者的標(biāo)本來(lái)自于胃鏡檢查時(shí)取得的胃黏膜，然后經(jīng)95%乙醇或4%醛固定；胃癌組的標(biāo)本來(lái)自于患者手術(shù)切除后，標(biāo)本經(jīng)4%醛固定。固定后的標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，然后制作切片。

1.4試劑和方法采用北京基因公司的試劑盒(GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT NO.56404)提取石蠟組織中的DNA。每例標(biāo)本連續(xù)切10～12片，每片厚5 μm，放入1.5 mL離心管中，然后按試劑盒操作說(shuō)明提取DNA。提取DNA后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增，上游引物5′GTA GTT TGC CCA AGG TCA AG 3′，下游引物5′AGC CAC CTG AGG GGT AAG 3′。擴(kuò)增條件：95 ℃12 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s 15個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s 25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，16 ℃保存。

取PCR產(chǎn)物2 μL，加限制性內(nèi)切酶BsmA I(購(gòu)于美國(guó)NEB公司)2 μL、NET緩沖液4 μL，然后加去離子水配成20 μL 體系，在37 ℃恒溫箱中，酶切3 h后，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化乙錠顯色10 min后觀察DNA條帶。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以比值比(odd ratio,OR)及其95%置信區(qū)間(confidence intervals,CI)表示各基因型發(fā)生不同疾病的風(fēng)險(xiǎn)。OR值以非條件Logistic回歸計(jì)算。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增的GSTP1基因片斷經(jīng)BsmA I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖譜GSTP1基因經(jīng)BsmA I酶切后出現(xiàn)3個(gè)分子量不同的等位基因片斷，分別為329 bp、222 bp以及107/104 bp，見(jiàn)圖1。

M 泳道為 DNA marker，1-4、6-8、10、12、14-16、19泳道為A/A純合子基因型；5、11、13、18泳道為A/G雜合子基因型；17 泳道為G/G純合子基因型；9泳道為陰性圖1　聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶P1基因片段經(jīng)BsmA I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2不同胃部疾病患者GSTP1第5外顯子基因多態(tài)性的分布經(jīng)性別和年齡校正后，非萎縮性胃炎組與GD組GSTP1患者第5外顯子G等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.011，P=0.006)，OR(95%CI)=2.381(1.271～4.461)，非萎縮性胃炎組與胃癌組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.440，P<0.05)，OR(95%CI)=3.042(1.631～5.675)，見(jiàn)表1。

表1　不同胃部疾病患者GSTP1第5外顯子

GSTP1：谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶P1； GD：胃黏膜非典型增生；等位基因頻率=純合基因型頻率×2+雜合基因型頻率

2.3第5外顯子G等位基因頻率在不同級(jí)別GD中的分布經(jīng)性別和年齡校正后，非萎縮性胃炎組患者GSTP1第5外顯子G等位基因頻率與低度GD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.388，P=0.232)，與高度GD組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.449，P=0.000)，OR(95%CI)=4.104(1.934～8.710)，與胃癌組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.440，P=0.000)，OR(95%CI)=3.042(1.631～5.675)；低度GD組患者GSTP1第5外顯子G等位基因頻率顯著低于高度GD組患者[χ2=5.260，P=0.022，OR(95%CI)=2.591(1.139～5.895)]和胃癌組患者[χ2=3.260，P=0.048，OR(95%CI)=1.100(1.001～1.208)]；胃癌組G等位基因頻率與高度GD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.481，P=0.488)，見(jiàn)表2。

表2　第5外顯子G等位基因頻率在

GD：胃黏膜非典型增生

3討論

目前，胃癌仍是全國(guó)范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，2008年全國(guó)疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)城鄉(xiāng)死因監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，新增胃癌病例464 439例，因胃癌而死亡者352 315例，胃癌發(fā)病率(年齡標(biāo)化率)為17.9/10萬(wàn)，病死率(年齡標(biāo)化率)為11.8/10萬(wàn)[8]。2011年全國(guó)腫瘤登記中心收集41個(gè)登記處、覆蓋66 138 784例 的報(bào)告中指出，在新發(fā)惡性腫瘤中，胃癌發(fā)病率和病死率占第2位[9]。為降低胃癌的發(fā)病率和病死率，人們對(duì)胃癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌的周圍經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些分化異常的腺管，后將此定義為GD，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其與胃癌密切相關(guān)，其是一種重要的癌前病變[10]。GD是胃癌發(fā)生前的重要一環(huán)，但什么情況下可發(fā)生胃癌并不明確。胃癌的發(fā)生是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)，人們?cè)谘芯凯h(huán)境因素致癌的同時(shí)，更注重胃癌發(fā)生的遺傳因素。研究顯示，基因多態(tài)性與胃癌相關(guān)，特別是具有解毒功能的代謝酶基因的多態(tài)性與胃癌的關(guān)系更為密切[11]。目前關(guān)于基因多態(tài)性的研究多數(shù)停留在胃癌階段，對(duì)胃癌發(fā)生前GD階段的研究甚少。

本研究結(jié)果顯示，50例胃癌和50例GD患者中存在GSTP1第5外顯子的變異，且胃癌組與GD組患者攜帶G等位基因的頻率均顯著高于非萎縮性胃炎組(P>0.05)，提示攜帶G等位基因的GD患者與胃癌患者有相似的遺傳特性，其能增加胃癌的發(fā)生率。推測(cè)這類患者可能是由于GSTP1第5外顯子突變，導(dǎo)致GSTP1所編碼的蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變，解毒功能降低，給環(huán)境致癌因素提供可乘之機(jī)。研究表明，位于第105位點(diǎn)的氨基酸序列對(duì)于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能十分重要，該位點(diǎn)氨基酸的替代改變蛋白質(zhì)的體積和疏水性，從而影響酶的熱穩(wěn)定性[12]。據(jù)報(bào)道，GSTP1酶-纈氨酸105的熱穩(wěn)定性比GSTP1酶-異亮氨酸105低[13]。該酶功能的改變可進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體損傷，甚至出現(xiàn)多基因改變，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。

不同類型的GD與胃癌的關(guān)系也不盡相同。目前臨床上對(duì)GD的組織分級(jí)也不統(tǒng)一，主要存在兩級(jí)和三級(jí)兩種方案。國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)療單位仍采用1978年我國(guó)胃癌協(xié)作組根據(jù)WHO分類原則制訂的三級(jí)分類分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將GD分為輕、中、重3級(jí)[10]。1998年4月在意大利的Podova來(lái)自西歐、北美及日本的9位胃腸病理學(xué)家共同制訂了兩級(jí)分類法并正式發(fā)表于《美國(guó)外科病理雜志》[14]。WHO試用并修改了這一方案，該方案將GD分為低度GD和高度GD。本研究也將GD分為低度和高度兩級(jí)，分別檢測(cè)GSTP1等位基因的分布頻率。結(jié)果顯示，GSTP1等位基因在低度組的分布規(guī)律與正常胃黏膜組相似，以A/A基因型為主；在高度GD組，該等位基因分布頻率與胃癌組相似。低度GD組與高度GD組比較，A等位基因頻率顯著降低。從正常胃黏膜→低度GD→高度GD→胃癌，A等位基因頻率逐漸降低，G等位基因頻率逐漸升高。結(jié)果提示，具有G等位基因的高度GD發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性高。這一結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究，同時(shí)對(duì)于攜帶G等位基因的GD患者要進(jìn)一步隨訪，并給予積極的治療，有望實(shí)現(xiàn)胃癌的一級(jí)預(yù)防。

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摘要：目的檢測(cè)胃黏膜非典型增生(GD)及不同程度GD患者谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)第5外顯子變異情況，探討GSTP1變異與胃黏膜GD的關(guān)系。方法選擇2008年3月至2012年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、沈陽(yáng)奉天醫(yī)院以及沈陽(yáng)第四人民醫(yī)院收集的150例胃部疾病患者為研究對(duì)象，根據(jù)疾病類型分為非萎縮性胃炎組(50例)、GD組(50例)以及胃癌組(50例)，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法檢測(cè)GSTP1第5外顯子變異情況(rs200139798)。結(jié)果胃癌組和GD組GSTP1第5外顯子攜帶G等位基因的頻率均高于非萎縮性胃炎組(P<0.05)；高度GD組攜帶G等位基因的頻率高于非萎縮性胃炎組和低度GD組(P<0.05)，與胃癌組相似(P>0.05)。結(jié)論GSTP1第5外顯子攜帶G等位基因的GD患者易發(fā)生胃癌，尤其是高度GD患者，臨床需予以重視。

關(guān)鍵詞：谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶P1；變異；非典型增生；等位基因

The Relationship between GSTP1 Genovariation and Gastric DysplasiaWANGXu-guang,ZHANGZhong,ZHANGMin,WANGYing. (DepartmentofPathology，ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the variation status of GSTP1 of exon 5 of the different degrees of gastric dysplasia(GD) and discuss the relationship between GD and GSTP1 genovariation.MethodsTotal of 150 gastric disease patients from the First Hospital Affiliated to China Medical University,Fengtian Hospital and the Fourth People′s Hospital of Shenyang during Mar. 2008 and Dec. 2012 were selected. The patients were divided into non-atrophic gastritis group(50 cases),gastric dysplasia group (50 cases) and 50 cases of gastric cancer according to the type of diseases.Using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphisms(PCR-RFLP) method to detect the variation of GSTP1(rs200139798).ResultsGastric cancer group and GD group carrying G allele frequency of GSTP1 exon 5 were higher than the non-atrophic gastritis group(P<0.05),high degree GD group carrying G allele frequency was higher than non-atrophic gastritis group and low degree GD group(P<0.05),it was similar to the gastric cancer group(P>0.05).ConclusionThe GD patients carrying G allele frequency of exon 5 GSTP1 were prone to develop stomach cancer,especially the patients with severe GD,and due attention should be paid in clinical.

Key words:Glutathione S transferase P1; Variation; Atypical hyperplasia; Allele

收稿日期：2014-06-21修回日期：2014-08-18編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.06.049

中圖分類號(hào)：R730.231

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)06-1088-03