胡蘆巴堿對(duì)缺氧／復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用＊

韓 坤，王丹萍，袁 磊△

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校分子生物實(shí)驗(yàn)室，河南漯河462000；2.河南省漯河市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 462000）

胡蘆巴堿（trigonelline，TRG）是一種生物堿，最早是從豆科植物葫蘆巴的干燥種子中提取出來(lái)的，故而得名，此后發(fā)現(xiàn)TRG 還廣泛存在于各種豆科植物的種子和咖啡中［1］。同時(shí)，TRG 還是人體內(nèi)煙酸和色氨酸的代謝產(chǎn)物［2］。TRG具多種生物學(xué)作用，如降低血糖血脂［3-4］、抑癌［5］、抗氧化［6］、改善記憶［7］和抗感染［8］等。最近的一項(xiàng)研究表明，TRG 具有心肌保護(hù)作用［9］。本研究通過(guò)建立乳鼠心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧模型，觀察胡蘆巴堿對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡、超氧化物歧化物（SOD）和丙二醛（MDA）水平、線粒體膜電位以及caspase-9和caspase-3活性的影響，以探究TRG 對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制，為治療心肌缺血再灌注損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 出生72h內(nèi)的SD 乳鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高糖DMEM 和胎牛血清（Hyclone公司），TRG、典化丙啶（PI）、Rhodamine123、procaspase-9 抗體、cleaved caspase-9、procaspase-3抗體和cleaved caspase-3抗體（Sigma公司），總SOD（TSOD）試劑盒和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 將出生3d 以內(nèi)的SD 乳鼠心室肌剪碎，用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化，采用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，用含20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔48小時(shí)更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 制備缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型 將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞換用預(yù)先經(jīng)95%N2和5%CO2混合氣體飽和1h 的缺氧液，于95% N2、5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)2h，再換用預(yù)先經(jīng)95% O2和5%CO2混合氣體飽和1h的復(fù)氧液，于95%O2、5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)4h，建立心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷模型［8-9］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照（Control組）：更換正常培養(yǎng)基后于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)6h；缺氧／復(fù)氧組（H／R 組）：更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2h，再更換復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4h；TRG 加缺氧／復(fù)氧組（TRG＋H／R 組）：更換含TRG（100nmol／mL）的缺氧液缺氧培養(yǎng)2h，再更換含TRG（100nmol／mL）的復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4h。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 制備各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用70% 冰乙醇于4 ℃固定24h，再用PBS洗2次，加入1mL PI染液，4℃避光染色30min，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 SOD 與MDA 檢 測(cè) SOD 的 測(cè) 定 采 用 黃 嘌 呤 氧 化 酶法，MDA 的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位 制備細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液漂洗2次，將Rhodamine123加入到細(xì)胞懸液（終濃度為5μg／mL），37 ℃孵育箱中放置30min，再用PBS緩沖液漂洗2次，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白水平 裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用封閉液（5%BSA／TBST）封閉1h，加入一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫下孵育1h，TBST 洗膜3次，加入ECL 進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，膠片用凝膠成像系統(tǒng)攜帶的白色光源拍照，β-actin蛋白條帶為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TRG 對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Control組、H／R 組和TRG＋H／R 組的細(xì)胞凋亡率分別為（5.2±0.9）%、（38.7±4.3）%和（24.1±3.6）%，H／R 組較Control組明顯升高（P＜0.05），TRG＋H／R 組較H／R 組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 TRG 對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.2 TRG 對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞SOD 活性和MDA 水平的影響 與Control組比較，H／R 組SOD 活性降低、MDA 水平升高（P＜0.05），說(shuō)明H／R 組細(xì)胞抗氧化能力降低。與H／R 組比較，TRG＋H／R 組SOD 活性增強(qiáng)、MDA 水平降低（P＜0.05）。見表1。

2.3 TRG 對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組樣本的熒光強(qiáng)度，用平均熒光強(qiáng)度值（mean fluorescence intensity，MFI）代表線粒體膜電位的水平。結(jié)果顯示，H／R 組MFI 3 789±221較Control組5 481±319大幅下降（P＜0.05），表明缺氧／復(fù)氧刺激使線粒體膜電位發(fā)生了顯著的去極化；TRG＋H／R 組MFI 4 36±257較H／R 組明顯升高（P＜0.05），說(shuō)明TRG 能夠穩(wěn)定線粒體膜電位。見圖2。

表1 各組SOD 活性和MDA 含量比較（±s）

表1 各組SOD 活性和MDA 含量比較（±s）

a：P＜0.05，與Control組比較；b：P＜0.05，與H／R 組比較。

組別 SOD（U／mgprot） MDA（nmol／mgprot）Control組115.81±10.63 3.13±0.46 H／R 組 54.24±8.71a 9.58±1.02a TRG＋H／R 組 81.66±9.38b 7.23±0.65 b

圖2 TRG 對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.4 TRG 對(duì)caspase-9 和caspase-3 活性的影響 Western blot結(jié)果顯示，H／R 組procaspase-9（p47）和procaspase-3（p32）較Control組明顯減少（P＜0.05），但cleaved caspase-9（p35）和cleaved caspase-3（p17）顯著增多，這表明缺氧／復(fù)氧刺激使caspase-9和caspase-3活化。TRG＋H／R 組procaspase-9（p47）和procaspase-3（p32）較H／R 組明顯增多（P＜0.05），cleaved caspase-9（p35）和cleaved caspase-3（p17）顯著減少（P＜0.05），表明TRG 可抑制缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的caspase-9 和caspase-3的活化。見圖3。

圖3 TRG 對(duì)caspase-9和caspase-3活性的影響

3 討 論

細(xì)胞凋亡在缺血／再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］。心肌缺血／再灌注所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂、線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放、鈣超載、氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡等均有關(guān)［11-14］。

在本研究中，乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧／復(fù)氧后，與Control比較，H／R 組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，說(shuō)明缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型建立成功。與H／R 組比較，TRG＋H／R 組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，說(shuō)明TRG 對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

參與心肌缺血再灌注損傷的自由基主要有羥自由基、過(guò)氧化氫和超氧陰離子等。心肌缺血再灌注時(shí)，自由基清除系統(tǒng)功能下降，從而產(chǎn)生大量的自由基。自由基可廣泛攻擊含不飽和脂肪酸的生物膜結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞膜結(jié)構(gòu)和功能并產(chǎn)生大量MDA。SOD 是人體最重要的自由基清除劑，當(dāng)自由基大量增多時(shí)SOD 消耗增加，SOD 活性就會(huì)下降［15］。因此有效阻止氧自由基產(chǎn)生并增強(qiáng)清除氧自由基的能力成為治療心肌缺血再灌注損傷的重要措施之一。

本研究結(jié)果顯示，與Control組比較，H／R 組心肌細(xì)胞內(nèi)MDA 水平顯著升高，同時(shí)SOD 活性顯著下降，表明缺氧／復(fù)氧過(guò)程使得脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)強(qiáng)烈，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，而TRG 可能通過(guò)增強(qiáng)心肌細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

缺血再灌注時(shí)所產(chǎn)生的鈣超載和氧自由基可促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開放，導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，線粒體高度腫脹，外膜破裂，線粒體膜間隙中的細(xì)胞色素C（Cyt C）和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等凋亡因子被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，繼而激活caspase-9和caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。線粒體膜電位去極化是線粒體功能逐漸喪失的關(guān)鍵階段。

本研究結(jié)果顯示，與Control組比較，H／R 組心肌細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生了顯著的去極化，procaspase-9和procaspase-明顯減少，但cleaved caspase-9和cleaved caspase-3顯著增多，這表明缺氧／復(fù)氧過(guò)程使得線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開放，caspase-9和caspase-3被激活。與H／R 組比較，TRG＋H／R組心肌細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著升高，cleaved caspase-9和cleaved caspase-3顯著減少，這表明TRG 對(duì)線粒體膜電位水平起到了穩(wěn)定作用，抑制了caspase-9和caspase-3的活化，這可能與其抗氧化能力有關(guān)，但其對(duì)心肌細(xì)胞鈣超載是否起到抑制作用尚待進(jìn)一步闡明。

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