miR-218在大腸癌中的表達及其臨床意義

許文劍，劉　明，蘇秀蘭

(1.內蒙古醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院普外科，呼和浩特 010020； 2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 a.腫瘤外科, b.臨床醫(yī)學研究中心,呼和浩特010050)

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miR-218在大腸癌中的表達及其臨床意義

許文劍1，劉明2a※，蘇秀蘭2b

(1.內蒙古醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院普外科，呼和浩特 010020； 2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 a.腫瘤外科, b.臨床醫(yī)學研究中心,呼和浩特010050)

摘要：目的研究miR-218在大腸癌與正常組織中表達的差異。方法應用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測60例大腸癌及相應正常組織中miR-218的表達水平，計算其相對表達量。結果60例大腸癌組織中miR-218的相對表達量為0.33±0.12，顯著低于對照組， miR-218的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-218在不同性別、年齡、腫瘤大體形態(tài)、組織學類型、臨床分期、浸潤深度、腫瘤分化程度上表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，有淋巴結轉移較無淋巴結轉移者表達量低(P<0.05)。結論miR-218在大腸癌中呈低表達，其表達水平越低可能提示淋巴結轉移越早，miR-218 可能作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

關鍵詞:大腸癌；miR-218；實時熒光定量聚合酶鏈反應

大腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤致死病因中排第4位[1]，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。腫瘤的復發(fā)、轉移、擴散仍是主要的致死原因。進一步研究大腸癌的發(fā)病機制、尋找更加有效的治療大腸癌的方法有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，微RNA(miRNA)在細胞增殖、分化、凋亡、基因調控及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，一些miRNA作為腫瘤抑制基因參與調解，另一些miRNA則作為癌基因發(fā)揮作用。采用基因芯片技術檢測多種腫瘤組織樣本中miRNA 的表達譜, 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA在腫瘤樣本中出現(xiàn)下調，少部分miRNA 表達水平上調。因此，對瘤中顯著表達差異的miRNA進行生物學功能研究是有重要意義的。本研究主要分析miR-218在大腸癌中的表達及臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年6月至2012年6月內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院手術切除并經(jīng)病理證實的大腸癌新鮮標本60例作為實驗組，相應的正常組織標本作為對照組，正常組織均取自腫瘤邊緣5 cm以上切緣陰性的無腫瘤組織。所有病例在術前均未接受化療或放療，并有完整的病例資料。

1.2實驗方法

1.2.1RNA提取與檢測標本離體后1 h內取得組織樣本，迅速放入無菌無酶凍存管內并置液氮中保存。TRIzol試劑法提取總RNA，使用DU800核酸蛋白分析儀(美國BECKMAN公司)檢測RNA水平，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.2反轉錄互補DNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒、miR-218 正向引物、反向引物(北京天根生化科技公司提供)，U6snRNA(中美泰和公司提供)。 U6正向引物： 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； U6反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應體系：2 μg總RNA；2 μL隨機引物；2 μL 高純度 dNTP；補RNase-Free ddH2O定容至14.5 μL。70 ℃加熱5 min后冷卻2 min，加入以下組系：4 μL 5倍濃度的第一鏈合成緩沖液(含有DTT)；0.5 μL RNasin。加1 μL(200 U)TIAN script M-MLV;25 ℃溫浴10 min;42 ℃溫浴50 min;95 ℃加熱5 min 終止反應，-20 ℃保存。

1.2.3聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)體系及條件4 ℃條件下在0.2 mL八聯(lián)管中加入如下反應體系：2×miRcute miRNA Premix 5 μL；50×ROX Reference Dye 0.8 μL；miR-218正向引物0.2 μL；反向引物0.2 μL；dd H2O 3.3 μL；互補DNA 0.5 μL，總體系10 μL。PCR反應條件：94 ℃ 2 min，1個循環(huán)；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，50個循環(huán)。

1.2.4檢測miR-218的相對表達量應用SYBR Green熒光定量PCR法，以U6snRNA作為內參，檢測大腸癌組織和正常組織的miR-218的相對表達量。

miR-218表達水平計算方法為RQ(相對表達量)=2-ΔΔCt。ΔCt=Ct(miR-218)-Ct(U6)；ΔΔCt=ΔCt (癌組織)-ΔCt (正常組織)。ΔCt值越高表明miR-218表達越低。在熒光定量PCR技術中，Ct(CyC1ethreshold)值表示每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。

2結果

本試驗中擴增曲線集中、光滑，有穩(wěn)定的平臺期，起峰位置位于20~30個ct值(圖1，圖2)，說明本次試驗引物的擴增效率、特異性和模板的量都比較合適。溶解曲線集中呈單峰(圖3，圖4)。

圖1　miR-218擴增曲線

圖2　U6擴增曲線

圖3　miR-218溶解曲線

圖4　U6溶解曲線

在60例癌癥患者中，2例miR-218的相對表達量>1, 58例<1, 其中4例<0.5。相對表達量為0.33±0.12。正常組織與癌組織的miR-218表達倍數(shù)2-ΔΔCt差異有統(tǒng)計學意義(t=17.32，P=0.00)。miR-218相對表達量，除淋巴結轉移外，其余各因素的不同水平間，表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　miR-218相對表達量與患者臨床病理特征的關系

3討論

通過分析更多的大腸癌患者，與非腫瘤組織相比，在大腸癌組織中miR-218的表達顯著下降。miR-218的低表達在結腸癌細胞系與正常結腸組織的對比中也被證實[2]。miR-218的下調也出現(xiàn)在其他癌癥中，包括胃癌[3-4]、神經(jīng)膠質瘤、鼻咽癌[5]、肺癌[6]、膀胱癌[7]。人體miR-218包含兩個不同的基因(miR-218-1和miR-218-2)，它們被加工成一個相同的成熟序列的編碼。miR-218-1和miR-218-2分別鑲嵌于染色體4p15.2上的SLIT2基因和染色體5q35.1上的SLIT3基因中的內含子區(qū)域。4p15.1~15.3區(qū)域經(jīng)常發(fā)生的缺失可導致大腸癌[8]。因此，在這個區(qū)域的雜合性缺失可能與大腸癌患者中miR-218的下調有關。另一方面，SLIT家族的宿主基因也常常在大腸癌中通過它們的啟動子甲基化而被滅活[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在對大腸癌細胞系使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷時，miR-218表達恢復；在鼻咽癌和口腔鱗狀細胞癌中miR-218通過啟動子的甲基化下調表達[10-11]。這些數(shù)據(jù)表明，CpG島(雙核苷酸基因組區(qū)段)的甲基化也可能會有助于miR-218在大腸癌中沉默。在大腸癌腫瘤起源階段，下調的miR-218意味著它可能作為一個潛在的腫瘤抑制基因而發(fā)揮作用。

本研究結果顯示，大腸癌組織中miR-218表達水平明顯低于正常組織，提示miR-218可能在大腸癌中起抑癌基因的作用，提高miR-218的表達水平可能是一種潛在的治療大腸癌的方法，從miR-218表達水平與大腸癌臨床病理特征之間的關系可以看出，miR-218表達水平在不同性別、年齡、腫瘤大體形態(tài)、組織學類型、臨床分期、浸潤深度、腫瘤分化程度中差異無統(tǒng)計學意義，與淋巴結轉移相關，有淋巴結轉移的較無淋巴結轉移者表達低。miR-218在大腸癌中表達水平越低可能提示淋巴結轉移越早，miR-218可能作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且有望作為大腸癌診斷與預后判斷的分子標志物。

參考文獻

[1]Yang L,Parkin DM,Li L,etal.Time trends in cancer mortality in China:1987-1999[J].Int J Cancer,2003,106(5):771-783.

[2]He X,Dong Y,Wu CW,etal.MicroRNA-218 inhibits cell cycle progression and promotes apoptosis in colon cancer by downregulating BMI1 polycomb ring finger oncogene[J].Mol Med,2012,18:1491-1498.

[3]Gao C,Zhang Z,Liu W,etal.Reduced microRNA-218 expression is associated with high nuclear factor kappa B activation in gastric cancer[J].Cancer,2010,116(1):41-49.

[4]Song L,Huang Q,Chen K,etal.miR-218 inhibits the invasive ability of glioma cells by direct downregulation of IKK-β[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,402(1):135-140.

[5]Alajez NM,Lenarduzzi M,Ito E,etal.MiR-218 suppresses nasopharyngeal cancer progression through downregulation of survivin and the SLIT2-ROBO1 pathway[J].Cancer Res,2011,71(6):2381-2391.

[6]Wu DW,Chuang CY,Lin WL,etal.Paxillin promotes tumor progression and predicts survival and relapse in oral cavity squamous cell carcinoma by microRNA-218 targeting[J].Carcinogenesis,2014,35(8):1823-1829.

[7]Tatarano S,Chiyomaru T,Kawakami K,etal.miR-218 on the genomic loss region of chromosome 4p15.31 functions as a tumor suppressor in bladder cancer[J].Int J Oncol,2011,39(1):13-21.

[8]Shivapurkar N,Maitra A,Milchgrub S,etal.Deletions of chromosome 4 occur early during the pathogenesis of colorectal carci-noma[J].Hum Pathol,2001,32(2):169-177.

[9]Dallol A,Morton D,Maher ER,etal.SLIT2 axon guidance molecule is frequently inactivated in colorectal cancer and suppresses growth of colorectal carcinoma cells[J].Cancer Res,2003,63(5):1054-1058.

[10]Alajez NM, Lenarduzzi M,Ito E,etal.MiR-218 suppresses nasopharyngeal cancer progression through downregulation of survivin and the SLIT2-ROBO1 pathway[J].Cancer Res,2011,71(6):2381-2391.

[11]Uesugi A,Kozaki K,Tsuruta T,etal.The tumor suppressive microRNA miR-218 targets the mTOR component Rictor and inhibits AKT phosphorylation in oral cancer[J].Cancer Res,2011,71(17):5765-5778.

Expression and Clinical Significance of miR-218 in Colorectal CancerXUWen-jian1,LIUMing2a,SUXiu-lan2b.(1.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010020,China; 2a.DepartmentofSurgicalOncology, 2b.ClinicalResearchCenter,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China)

Abstract：ObjectiveTo study the expression levels of miR-218 in colorectal cancer and normal tissues.MethodsUsing real-time quantitative polymerase chain reaction to detect the expression levels of miR-218 in 60 cases of colorectal cancer and the corresponding normal tissues,and calculate its relative expression.ResultsThe relative expression of miR-218 in the tissues of 60 patients with colorectal cancer was 0.33±0.12, it was significantly lower than the control group, the difference was statistically significant (P<0.05);there was no statistically significant difference in the expression of miR-218 in the general form of gender,age,tumor histological type,clinical stage,depth of invasion,and the degree of tumor differentiation(P>0.05); there was lower expression in lymph node metastasis than in those without lymph node metastasis(P<0.05).ConclusionmiR-218 shows low expression in colorectal cancer. Its lower expression levels may indicate earlier lymph node metastasis. miR-218 may act as a tumor suppressor gene involved in tumor development.

Key words:Colorectal cancer； miRNA-218； Real time-polymerase chain reaction

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-01-25編輯:薛惠文

基金項目：國家自然科學基金(81160254)；內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重大項目(NYFYZD2010008)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.09.052

中圖分類號:R735.35

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)09-1674-03