柚皮中柚皮苷和類檸檬苦素的提取及分離純化

楊秋明，李靖雅，肖安風，陳　俊

(1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，

福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021；

4.廈門南方海洋研究中心經濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

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柚皮中柚皮苷和類檸檬苦素的提取及分離純化

楊秋明1,2,3,4，李靖雅1，肖安風1,2,3,4，陳俊1,2,3,4

(1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，

福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021；

4.廈門南方海洋研究中心經濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

[摘要]用熱水煮提法提取出柚皮中柚皮苷和類檸檬苦素等大量苦味活性物質，通過靜態(tài)吸附-解吸試驗，篩選出具有較大吸附和解吸率的D101大孔吸附樹脂進行分離純化，得出最優(yōu)的吸附條件：樹脂添加量3.0%(質量分數)，25 ℃恒溫條件下搖床以180 r/min振蕩90 min.在此條件下，柚皮苷和檸檬苦素吸附率都達到100%.吸附完全后進行動態(tài)洗脫，洗脫液再通過萃取和重結晶后可有效分離純化柚皮苷和檸檬苦素類似物，純化后的樣品用HPLC法測得柚皮苷純度達到95.8%，用紫外分光光度法測得檸檬苦素類似物純度達到90.9%.

[關鍵詞]柚皮苷；檸檬苦素類似物；大孔吸附樹脂；分離純化

0引言

柚皮苷(4,5,7-trihydroxy flavanone-7-β-L-rhamnoglucoside-(1,2)-α-D-glucopyranoside)是一種二氫黃酮糖苷類化合物，它是蕓香科植物如葡萄柚、蜜柚、酸橙等的主要苦味物質[1].常溫下的柚皮苷在水中的溶解度為1 g/L，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀堿溶液及熱水.檸檬苦素(Limonin)類化合物是三萜系后苦味化合物[2-3]，主要存在于蕓香科植物果實中，易溶于溶酯性有機溶劑，難溶于水，在甲醇、乙醇中溶解度較大.

柚皮苷作為柚汁當中的主要苦味物質，具有很高的藥用價值.柚皮苷生物活性高，具有很好的抗氧化作用[4]，對致突變性具有抑制作用[5-7]，具有抗癌防癌等功能[8-11].因此，在醫(yī)藥工業(yè)上，柚皮苷可用于生產防治心腦血管疾病及消炎類的藥物[12-13].類檸檬苦素也有生物學功能，如對人體乳腺癌細胞的抗癌功能[14]、鎮(zhèn)痛抗炎作用[15-16]、抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用以及昆蟲拒食功能[17].雖然柚皮苷和類檸檬苦素都具有生物活性，但過多的含量會影響商品果汁的感官質量，使消費者難以接受，從而降低了果汁的商品價值，因此需要進行脫苦處理.脫苦處理的方法有很多，目前在應用大孔吸附樹脂進行柑橘汁脫苦方面有一些報道：文獻[18-20]使用Amberlite XAD系列樹脂對柑橘汁進行脫苦效果很好，且對營養(yǎng)成分影響較少；2009年，邢建榮等利用HZ樹脂對胡柚汁進行脫苦，柚皮苷和檸檬苦素的脫除率分別達64.6%和76.7%[21].本文選取優(yōu)良樹脂進行靜態(tài)吸附工藝的優(yōu)化，并通過動態(tài)洗脫分離純化柚皮苷和類檸檬苦素，并結合萃取和結晶的方法使柚皮脫苦.

1材料與方法

1.1　材料與試劑

琯溪蜜柚，購自漳州市平和縣琯溪鎮(zhèn)；AB-8、DM130、D4020、D101、D101-I大孔吸附樹脂，購自杭州星群儀器公司.

甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國 Tedia公司；其他試劑均為國產分析純.

1.2　儀器與設備

Waters 2489高效液相色譜儀(配有Binary泵、2695紫外檢測器、Waters System Breeze系統(tǒng)控制和數據處理工作站)，購自美國Waters公司；Unic 7200紫外可見分光光度計，購自尤尼柯(上海)儀器有限公司.

1.3　方法

1.3.1柚皮苷及檸檬苦素的提取

采用熱水煮提法，具體過程為：將原料中霉爛、蟲蛀及有病蟲害疤痕的柚皮去除，用刀削去除接近果肉部分疏松的白皮組織，將柚皮切成1 cm×2 cm大小的塊，采用鹽的質量分數為0.8%，料液比為20∶1(g∶L)，每次煮沸2~3 min，進行4次鹽水煮沸.水煮液用4層紗布過濾，取少量水煮液測定其中柚皮苷和檸檬苦素的含量.

1.3.2大孔吸附樹脂篩選

1.3.2.1大孔吸附樹脂預處理

樹脂先經漂浮法進行篩選，再用體積分數95%的乙醇浸泡24 h，充分溶脹，浸泡過程中保持樹脂完全被浸沒.然后濕法上柱，用體積分數95%乙醇通過樹脂層，直至流出液不呈白色渾濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗至流出液無乙醇味，然后用質量分數2%的鹽酸溶液通過樹脂層，并浸泡3 h，而后用蒸餾水洗至流出水的pH值呈中性(操作2遍)，待用.

1.3.2.2靜態(tài)吸附

稱取經預處理后濾干水分的5種樹脂各0.27 g于50 mL三角瓶中，加入15 mL提取液，以25 ℃、180 r/min恒溫搖床中恒速振蕩12 h，取適量提取液，測定柚皮苷、檸檬苦素的含量，計算5種樹脂對柚皮苷和檸檬苦素的吸附率.

1.3.2.3靜態(tài)解吸

取吸附飽和的樹脂，用去離子水洗去表面未被吸附的提取液，加入30 mL體積分數70%的乙醇溶液，25 ℃、180 r/min恒溫搖床中恒速振蕩12 h，取適量解吸液，檢測柚皮苷和檸檬苦素的含量，計算各樹脂的解吸率.

1.3.3靜態(tài)吸附等溫曲線

1.3.4靜態(tài)吸附動力學曲線測定

準確稱取D101樹脂0.36 g于3個100 mL錐形瓶中，均加入50 g提取液，于25 ℃搖床以180 r/min 振蕩12 h，分別在1，2，3.5，5，7，9，12 h取樣測定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素的含量，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線.

1.3.5單因素試驗

稱取樹脂0.25 g，加入20 g提取液，于25 ℃恒溫搖床中以180 r/min振蕩2 h，取樣測定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素含量，計算樹脂吸附量.在保持其他條件不變的情況下分別改變樹脂添加量、吸附時間、吸附溫度、振蕩速率進行單因素試驗.

1.3.6動態(tài)洗脫

吸附完全的樹脂濕法上柱，先用大量水淋洗至淋洗液無色并用濃硫酸檢測不出糖；然后用體積分數為30%的乙醇洗脫；流速約為1 Bv/h，約每3 mL接一管，用薄層色譜法對洗脫液中成分進行跟蹤檢測定性，將成分相同的洗脫液進行合并，并減壓蒸餾濃縮得濃縮物.

1.3.7萃取純化

濃縮物用體積分數50%的甲醇溶解后，用兩倍體積的石油醚萃取3次，將得到的兩部分分別濃縮.甲醇部分濃縮后用體積分數70%的乙醇溶解后測其純度，石油醚部分濃縮后用乙腈溶解測其純度.

1.4　計算

吸附率/%=(C0-Ce)/C0×100；解吸率/%=C1V1/[(C0-Ce)V]×100，其中：Ce是平衡的質量濃度；C1是解析液的質量濃度；C0是初始的質量濃度；V是吸附液體積；V1是解析液體積.

2結果與分析

2.1　熱水煮提

柚皮苷易溶于熱水，通過加熱處理可使其溶出，且加熱使柚皮細胞壁軟化，柚皮中的苦味物質更容易隨可溶性固形物一起溶出.隨著柚皮煮沸次數的增加，煮出液中苦味物質溶出越來越少，在柚皮煮沸3~4次時，可以將柚皮中大部分苦味物質釋放到煮出液中.經檢測，煮出液中約含有柚皮苷154.25 μg/mL，檸檬苦素53.33 μg/mL.

2.2　大孔吸附樹脂篩選

選擇不同極性和不同平均孔徑的樹脂進行靜態(tài)吸附和靜態(tài)解析實驗，結果如表1所示.由表1可知，平均孔徑最大的D101樹脂對柚皮苷的吸附率和解吸率都最高，對檸檬苦素的解吸率可以達到100%，可能由于孔徑大，活性物質更容易進入樹脂內，也更容易脫離樹脂被解吸出來.綜合考慮5種樹脂的吸附率和解吸率，選擇D101進行下一步試驗.

表1　5種樹脂對柚皮苷和檸檬苦素的吸附能力

2.3　靜態(tài)吸附等溫模型

目前，大孔吸附樹脂吸附作用的機制普遍歸結為Freundlich或Langmuir模型，本實驗采用Langmuir方程和Freundlich方程對實驗數據進行擬合，柚皮苷及檸檬苦素擬合參數如表2所示.可見，Langmuir和 Freundlich等溫吸附模型線性相關性符合均較好，但是相比而言，Langmuir等溫吸附模型符合得更好；柚皮苷吸附在 Freundlich吸附等溫式中參數n=3.61， 在2~10之間，表明吸附容易發(fā)生，而且是一個優(yōu)惠吸附過程.

表2　D101樹脂對柚皮苷和檸檬苦素等溫吸附模型參數

2.4　靜態(tài)吸附動力學曲線

由吸附量隨時間的變化曲線(如圖1所示)可以看出，該曲線為指數形式，吸附量剛開始的階段上升較快，吸附5 h后基本達到平衡，說明D101樹脂達到吸附平衡所需要的時間較短，對柚皮苷和檸檬苦素的選擇吸附性好.

2.5　樹脂添加量的確定

改變樹脂添加量，在25 ℃、140 r/min條件下振蕩2 h，取樣測定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素的含量，結果如圖2所示.由圖2可以看出，樹脂添加量的增多可以提高柚皮苷和檸檬苦素的吸附率，這是由于樹脂量增多使得樹脂的總吸附表面積增大，一定時間內吸附的活性物質相應增多.當樹脂的添加量為3.0%(質量分數)時，柚皮苷和檸檬苦素已全部被吸收.因此，確定樹脂的最佳添加量為3.0%(質量分數).

2.6　吸附時間的確定

固定樹脂添加量為3.0%(質量分數)，在25 ℃恒溫條件下，搖床以140 r/min振蕩2 h，時間為15，30，45，55，65，80，90，105，120 min進行取樣測定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素的含量，結果如圖3所示.由圖3可知，隨著吸附時間的增加，柚皮苷和檸檬苦素的吸附量呈現出增加的趨勢.當吸附時間達到90 min時，柚皮苷吸附率達到穩(wěn)定，檸檬苦素吸附量變化不大.因此，確定最佳吸附時間為90 min.

2.7　吸附溫度的確定

固定樹脂添加量為3%(質量分數)，振蕩速度140 r/min，吸附時間為90 min，考察溫度10，15，20，25，30，35 ℃對吸附率的影響，結果如圖4所示.由圖4可以看出，溫度對檸檬苦素的吸附率影響較大，而對柚皮苷吸附率影響較小.這可能是由于溫度的升高，導致了樹脂的內部結構變得更為松弛，從而增大了活性物質向樹脂內滲透.由于D101樹脂對柚皮苷吸附為優(yōu)惠型吸附，所以溫度對其影響不大，但是卻增加了對檸檬苦素的吸附量.當溫度為25 ℃時，檸檬苦素的吸附率隨溫度變化趨于平緩.因此，本試驗選擇25 ℃作為樹脂吸附溫度.

2.8　振蕩速度的確定

固定樹脂添加量為3%(質量分數)，于25 ℃恒溫條件下振蕩90 min，考察轉速100，120，140，160，180，190 r/min對吸附率的影響，結果(見圖5)表明：5個不同振蕩速度下吸附率的變化不大，說明振蕩速度對吸附率沒有明顯的影響.這可能與在100~180 r/min的轉速條件下，柚皮苷和檸檬苦素均能與樹脂充分接觸有關.

2.9　動態(tài)洗脫及純化結果

固定樹脂添加量為3%(質量分數)，于25 ℃恒溫條件下，轉速180 r/min振蕩90 min吸附完全，動態(tài)洗脫，結果見表3.由表3可計算得洗脫下來的500 mL 70%體積分數乙醇中檸檬苦素類似物質量濃度為15.44 μg/mL，質量約7.72 mg.洗脫液蒸干后用石油醚萃取純化，石油醚部分再蒸干后得到固體質量為8 mg，則得到檸檬苦素類似物理論上為96.5%.由于萃取過程中有一定量檸檬苦素類似物的損失，8 mg固體用100 mL乙腈溶解后測得檸檬苦素類似物濃度為(72.75±1.23) μg/mL，純度為(90.9±1.54)%.

由圖6a可以看出，用體積分數70%乙醇洗脫后的液體中基本不含柚皮苷，檸檬苦素類似物較純，隨流動相展開的成分中，在最上邊有少量的其他成分，不是檸檬苦素，推測為檸檬苦素類似物.由圖6b可以看出用體積分數30%乙醇洗脫后柚皮苷含量很高，且不含其他黃酮類物質.為了確定分離純化得到的柚皮苷樣品的純度，分別對柚皮苷樣品和標準品進行HPLC分析，所得結果如圖7和圖8所示.從圖7和圖8中可以看出，柚皮苷樣品及標準品的色譜圖的峰形及保留時間基本一致，說明樣品中柚皮苷的含量較高，根據面積外標法測得柚皮苷樣品的純度為95.8%.

表3 動態(tài)洗脫結果Tab.3 Theresultofdynamicelution洗脫液Elutionliquidρ(柚皮苷Naringin)/(μg·mL-1)ρ(檸檬苦素類似物Limonoids)/(μg·mL-1)提取液Extract215.75±3.5032.75±1.01樹脂吸附后Resinadsorption0030%乙醇洗脫30%ethanolelu-tion136.75±1.150500mL70%乙醇洗脫500mL70%Ethanolelution3.25±1.0315.44±1.12

3結論

1)采用熱水煮提法提取柚皮中的苦味物質柚皮苷和檸檬苦素，提取液中約含有柚皮苷154.25 μg/mL，檸檬苦素53.33 μg/mL.

2)用靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸試驗篩選出具有較大吸附和解吸率的D101大孔吸附樹脂對提取液進行靜態(tài)吸附，得出最優(yōu)的吸附條件：樹脂添加量3.0%(質量分數)，25 ℃恒溫條件下搖床以180 r/min 振蕩90 min.

3)吸附完全后進行動態(tài)洗脫，洗脫液再通過石油醚3次萃取和重結晶后可有效分離純化出柚皮苷和檸檬苦素類似物，純化后樣品用TLC法結合HPLC法有效地鑒別和測得柚皮苷純度達到95.8%，紫外分光光度法測得檸檬苦素類似物純度達到90.9%.

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(責任編輯馬建華英文審校曹敏杰)

Extraction and Purification of Naringin and Limonoids from Pomelo PeelYANG Qiu-ming1,2,3,4，LI Jing-ya1，XIAO An-feng1,2,3,4，CHEN Jun1,2,3,4

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China；2.Key Laboratory of Food

Microbiology and Enzyme Engineering of Fujian Province,Xiamen 361021,China；3.Research Center of Food Biotechnology

of Xiamen,Xiamen 361021,China；4.Key Laboratory of Recycling Application and Deep Processing in Economic Marine

Alga,Xiamen South Oceanographic Research Center,Xiamen 361021,China)

Abstract:Bitterness active components such as naringin and limonoids were extracted by heating water.By means of adsorption-desorption experiments,the macro porous resin D101 was selected for isolation and purification of naringin and limonoids from pomelo peel due to its higher adsorption and desorption rate.The adsorption condition was optimized in the presence of 3% resin with absorption time of 90 min,at 25 ℃ and rotation speed of 180 r/min.After complete adsorption,the resulting solution was applied to dynamic-state elution.Naringin and limonoids were separated and purified effectively via concentration of the eluent and recrystalization.The samples thus prepared were determined by HPLC and UV spectrophotometer,the purities of naringin and limonoids reached 95.8% and 90.9%,respectively.

Key words:naringin;limonoids;macro porous resin;separation and purification

[中圖分類號]TS 255.1

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-7405(2015)06-0414-07

[作者簡介]楊秋明(1977—),男,高級實驗師,主要從事食品微生物及工藝方面的研究.通信作者：陳俊(1977—)，男，副教授，從事藥學研究，E-mail:chenjun@jmu.edu.cn.

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(31271914)；福建省科技計劃重點項目(2011N1008)；福建省教育廳科技項目(JA11160)

[收稿日期]2014-09-30[修回日期]2015-09-28