糖腎寧對糖尿病腎病大鼠腎組織nephrin、desmin表達(dá)的影響

鄒大威　高彥彬　李嬌陽　周盛楠　王馨瑤　龔慕辛　耿建國　王金羊　朱智耀　張娜

糖腎寧對糖尿病腎病大鼠腎組織nephrin、desmin表達(dá)的影響

鄒大威高彥彬李嬌陽周盛楠王馨瑤龔慕辛耿建國王金羊朱智耀張娜

【摘要】目的探討糖腎寧對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球足細(xì)胞損傷的影響。方法

8周齡SPF級雄性SD大鼠46只，隨機選擇10只為對照組，其余大鼠予大劑量STZ腹腔注射建立糖尿病模型。其中34只大鼠血糖≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功，隨機分為模型組、纈沙坦組、糖腎寧組，予糖腎寧及纈沙坦干預(yù)12周，測定空腹血糖、血清尿素氮、血清肌酐、24小時尿蛋白，足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin、骨架蛋白desmin的蛋白或基因表達(dá)。結(jié)果與對照組比較,模型組大鼠空腹血糖、血清尿素氮、血清肌酐、24小時尿蛋白均明顯升高(P<0.05)，desmin蛋白、基因表達(dá)上調(diào)(P<0.05)、nephrin mRNA表達(dá)下調(diào) (P<0.05)；與模型組比較，糖腎寧、纈沙坦干預(yù)后， desmin蛋白、基因表達(dá)下調(diào)(P<0.05)、nephrin mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，血清尿素氮、血清肌酐、24小時尿蛋白顯著降低(P<0.05)，但血糖無明顯變化 。結(jié)論糖腎寧干預(yù)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠可減少腎小球足細(xì)胞損傷，降低蛋白尿、保護(hù)腎功能。

【關(guān)鍵詞】糖尿病腎??；足細(xì)胞損傷；糖腎寧

最新的研究表明中國成年人群的糖尿病總體發(fā)病率約為11.6%，糖尿病前期的發(fā)病率是50.1%，估計中國約有1.139億糖尿病患者, 4.934億糖尿病前期患者[1]，糖尿病腎病( diabetic nephropathy , DN) 是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥, 是導(dǎo)致終末期腎衰竭和糖尿病患者死亡的主要原因，因此，防治糖尿病腎病具有重要意義。既往研究認(rèn)為, DN 的主要病理特征是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積、系膜增寬、基底膜增厚, 腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化[2]。近年來，腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變, 尤其是作為腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)成分的足細(xì)胞在DN發(fā)生、發(fā)展中的作用，日益成為研究熱點[3-4]。研究表明足細(xì)胞損傷是DN持續(xù)進(jìn)展、蛋白尿持續(xù)增加的關(guān)鍵因素[5]，因此積極尋找減輕足細(xì)胞損傷，控制DN病情進(jìn)展的中藥迫在眉睫。糖腎寧復(fù)方臨床應(yīng)用治療糖尿病腎病多年，效果顯著，臨床試驗研究也表明該藥可明顯降低DN患者尿蛋白，改善腎功能，療效優(yōu)于洛汀新[6]。筆者旨在通過本實驗探討糖腎寧減少蛋白尿、保護(hù)腎功能的作用機制，是否部分與減輕腎小球足細(xì)胞損傷相關(guān)。

1材料與方法

1.1動物

8周齡SPF級雄性SD大鼠46只[生產(chǎn)許可號:SCXK(京)2012-0001]，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2干預(yù)藥物與試劑

干預(yù)藥物:糖腎寧(配比:黃芪4份、葛根2份，川芎2份，大黃1份，金櫻子2份、倒扣草3份，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥制劑室制備成浸膏粉)；纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司，80 mg x7粒，批號：X1448)。

試劑:Trizol試劑盒(批號:30B00150，NEP019-2，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:TRT-101，TOYOBO,日本)，鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)(Sigma,美國)，尿蛋白定量檢測試劑盒(批號:20130820，C035-2，南京建成,中國)，desmin抗體(ab32362,Abcam,英國)，山羊抗兔二抗(即用型sp-9001，中杉金橋，中國)，肌酐測定試劑盒(批號：657881,ROCHE, 瑞士)，尿素氮測定試劑盒(批號：658513,ROCHE,瑞士)。

1.3儀器

實時熒光定量PCR儀(PRISM 7700，ABI,美國)，凝膠成像分析儀(WD-9413，北京市六一儀器廠,中國)，紫外分光光度儀(Q-5000 ，Quwell，美國)，模塊化生化免疫分析系統(tǒng)(Cobas 6000 C501, Roche)，生物顯微鏡(ECLIPSE 80i,Nikon,日本)。

1.4實驗方案

本實驗采用大劑量STZ(60 mg/kg)誘導(dǎo)8周齡雄性SD大鼠建立糖尿病模型，空腹血糖≥16.7 mmol/L 認(rèn)為糖尿病模型建立成功。造模成功的43只糖尿病大鼠隨機分為模型組M(n=12)、糖腎寧組TSN(n=11)、 纈沙坦組XST(n=11)，另設(shè)10只非糖尿病大鼠為對照組(NC)。糖尿病模型成功后立即干預(yù)給藥，XST組予纈沙坦10 mg/kg·d灌胃，TSN組予糖腎寧(生藥20 g/kg·d,按浸膏粉/生藥比換算配制藥物)灌胃，NC組及M組均予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥12周。實驗期間，于給藥0點、給藥1個月、給藥2個月、給藥3個月，稱量體質(zhì)量，采用尾靜脈取血法動態(tài)監(jiān)測各組大鼠血糖，代謝籠收集24小時尿液，考馬斯亮藍(lán)法測定24小時尿蛋白含量。

1.5指標(biāo)收集與檢測

給藥3個月末，大鼠禁食12小時于次日清晨處理大鼠。根據(jù)大鼠體質(zhì)量，用10%水合氯醛麻醉大鼠(300 mg/kg)，暴露腹腔，進(jìn)行腹主動脈取血，分離血清4℃保存。采用苦味酸法測定血清肌酐，采用尿酶紫外速率法測定血清尿素氮。取腎臟縱切，部分10%多聚甲醛固定、石臘包埋,切成4μm厚的切片,進(jìn)行HE染色及desmin免疫組化染色。部分用預(yù)冷的生理鹽水洗去血漬和雜質(zhì)，取腎皮質(zhì)迅速放入液氮中保存，待測desmin及nephrin基因表達(dá)水平。

1.6腎組織nephrin、desmin mRNA檢測

從GeneBank獲得目的基因mRNA的全長序列，利用引物和探針設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計引物序列。經(jīng)過Blast分析，引物序列具有特異性。(見表1)。取大鼠腎組織80 mg，采用Trizol提取RNA，并用DNase純化RNA。以總RNA為模板，使用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，在實時熒光定量PCR儀上擴增并檢測熒光，每個樣本均做3次，取平均值減少誤差，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法[7]對desmin、nephrin mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。

1.7腎組織免疫組織化學(xué)測定

將4%的多聚甲醛固定的腎組織石蠟包埋，制成石蠟切片，厚度 4 μm，0.01M PBS在微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，滴入5%H2O2微波爐內(nèi)4～5分鐘滅活內(nèi)源性酶，0.01M PBS漂洗3次。加入1:50濃度的desmin一抗，37℃ 90分鐘，0.01M PBS漂洗3次，滴入適當(dāng)二抗，37℃ 25分鐘，PBS漂洗3次各5分鐘， DAB染色，鏡下控制反應(yīng)時間，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.8計算機圖像半定量分析

每組隨機選取3張腎組織切片，使用尼康ECLIPSE 80i 生物顯微鏡在400倍視野下采集圖像，每張切片隨機選擇5個腎小球。用NIS-Elements BR 3.2圖像分析軟件計算腎小球desmin陽性面積，計算每個腎小球內(nèi)desmin的陽性信號面積比。公式：desmin陽性信號面積比=desmin陽性染色面積(μm2)/腎小球面積(μm2)。

1.9統(tǒng)計方法

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況及體重、血糖的比較

實驗過程中，對照組大鼠無死亡，給藥1個月時間點模型組、纈沙坦組各死亡1只、給藥3個月時間點模型組、糖腎寧組各死亡1只。STZ腹腔注射后大鼠血糖明顯升高(P<0.05)，給藥0周各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05)；與對照組相比，給藥1、2、3個月的模型組大鼠的血糖升高且穩(wěn)定、體重明顯較少(P<0.05)，；與模型組相比，給藥1、2、3個月的纈沙坦組、糖腎寧組大鼠的體質(zhì)量、血糖無明顯差異(P>0.05)。各給藥組大鼠體質(zhì)量、血糖無明顯差異(P>0.05)。見表2、表3。

表1　Neprhin、Desmin基因引物序列

注：F 上游引物；R 下游引物

組別血糖(mmol/L)給藥0月1月2月3月對照組 5.79±0.3355.85±0.3445.61±0.495.64±0.60模型組 30.40±1.448a31.09±1.52a31.38±1.68a31.33±1.94a纈沙坦組30.34±1.22a30.57±1.68a31.26±1.66a31.63±1.46a糖腎寧組30.85±1.46a31.18±1.18a31.05±1.66a31.17±2.43a

注：與對照組比較，aP<0.05

組別體質(zhì)量(g)給藥0月1月2月3月對照組 233.3±15.59508.66±57.85563.72±52.28556.18±63.09模型組 233.44±11.73a317.02±62.54a327.59±59.29a287.04±63.45a纈沙坦組232.79±11.49a329.01±59.68a343.68±69.81a305.80±58.86a糖腎寧組234.59±12.45a339.45±57.94a331.48±58.91a311.60±73.31a

注：與對照組比較，aP<0.05

±s，n=9～10)

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05; 對照組10只,余組9～10只

±s，n=8)

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.2各組大鼠24小時尿蛋白排泄比較

與對照組相比，給藥1、2、3個月的模型組大鼠的尿蛋白含量明顯升高(P<0.05),提示DN模型建立成功。與模型組相比，給藥1、2、3個月的纈沙坦組、糖腎寧組大鼠的24小時尿蛋白均有不同程度的降低(P<0.05),各干預(yù)組組間比較無顯著差異(P>0.05)。實驗結(jié)果表明糖腎寧具有明顯的降低糖尿病大鼠尿蛋白的作用。見表4。

2.3各組大鼠血清肌酐、血清尿素氮比較

與對照組相比，給藥3個月的模型組大鼠的血清肌酐、血清尿素氮含量明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，纈沙坦、糖腎寧干預(yù)3個月后，血清肌酐、血清尿素氮均有不同程度的降低(P<0.05),各干預(yù)組組間比較無顯著差異(P> 0.05)。實驗結(jié)果表明糖腎寧具有保護(hù)腎功能的作用。見表5。

2.4糖腎寧對足細(xì)胞desmin、nephrin基因表達(dá)的影響

采用實時熒光定量PCR方法檢測各組nephrin、desmin mRNA表達(dá)，結(jié)果表明，與對照組相比，模型組大鼠腎組織nephrin mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，desmin mRNA明顯升高(P<0.05) ；與模型組相比，糖腎寧、纈沙坦干預(yù)3個月后大鼠腎組織nephrin mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，desmin mRNA明顯降低(P<0.05)(P<0.05)，各干預(yù)組組間比較無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

2.5免疫組化法檢測各組腎組織desmin的表達(dá)

如圖所示，光鏡下棕褐色為陽性染色。對照組的desmin蛋白表達(dá)較少，模型組的desmin蛋白主要表達(dá)在足細(xì)胞中，可見大量表達(dá)(見圖2)，大鼠腎小球desmin陽性面積比明顯增高(P<0.05)，纈沙坦及糖腎寧組大鼠陽性染色減弱，與模型組相比有差異(P<0.05)。(見圖2，表6)

NC：對照組　STZ:模型組　XST:纈沙坦組　TSN:糖腎寧組注：　與對照組比較，aP<0.05；　與模型組比較，bP<0.05圖1　給藥12周末各組大鼠腎組織nephrin、desmin基因表達(dá)量的比較

NC　　　　　　　　　　　STZ

XST　　　　　　　　　　　TSN　NC：對照組　STZ:模型組　XST:纈沙坦組　TSN:糖腎寧組圖2　給藥12周末各組大鼠腎組織免疫組化desmin的表達(dá)(×400)

組別desmin陽性面積比對照組 0.09±0.02模型組 0.81±0.10a纈沙坦組 0.45±0.13ab糖腎寧組 0.48±0.11ab

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3討論

本實驗采用中藥糖腎寧防治糖尿病腎病，該藥在臨床應(yīng)用及臨床試驗研究中均獲得較好療效。高彥彬教授認(rèn)為糖尿病腎病是消渴病日久，久病入絡(luò)所引起的尿濁、水腫、腰疼、關(guān)格等腎系并發(fā)癥，病位在腎，繼發(fā)于消渴病，因此稱為消渴病腎病。DN的基本病機是腎元虧虛、腎氣不固、腎絡(luò)瘀阻、濁毒內(nèi)停。針對其病機特點，絡(luò)病理論結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，高彥彬教授研制出中藥復(fù)方糖腎寧，其中黃芪益氣固表，利水消腫，金櫻子固腎攝精，丹參活血化瘀，大黃瀉熱通腑，逐瘀降濁，全方共奏益氣固腎、化瘀通絡(luò)降濁之效。

本實驗采用大劑量STZ腹腔注射SD大鼠建立模型，該方法具有成模率較高、簡單易行的特點，實驗過程中，動態(tài)檢測血糖，血糖基本處于>25 mmol/L的高值，表明糖尿病動物模型穩(wěn)定成功。糖腎寧對血糖沒有明顯的影響，表明中藥糖腎寧發(fā)揮的減輕DN足細(xì)胞損傷的作用與降低血糖無關(guān)。STZ注射4周后測定模型組24 h尿蛋白含量可達(dá)到45 mg/24h左右，明顯高于對照組，說明DN模型成功建立，這與文獻(xiàn)報道是一致的[8]。纈沙坦是血管緊張素受體1拮抗劑的代表藥物，因其具有公認(rèn)的降低尿蛋白的作用，常作為陽性對照藥物[9]，在本實驗中糖腎寧能夠穩(wěn)定的降低尿蛋白、改善腎功能，與纈沙坦的作用不相上下(P>0.05)。

腎小球濾過屏障由腎小球基底膜(glomerular basement membrance, GBM)、足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成。腎小球足細(xì)胞是濾過屏障的最外一層防線，其主要特征是自細(xì)胞體伸出很多指狀突起并且相鄰的突起末端之間形成裂孔隔膜，對于阻遏蛋白漏出起關(guān)鍵作用。足細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白表達(dá)下調(diào)、足細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)異常。腎病蛋白nephrin是構(gòu)成裂孔隔膜的主要蛋白，結(jié)蛋白desmin是構(gòu)成足細(xì)胞骨架的中間絲蛋白。本實驗旨在通過探討糖腎寧對desmin、nephrin的調(diào)控作用，分析該藥對DN足細(xì)胞損傷的影響。

足細(xì)胞裂孔隔膜由nephrin、Podocin、CD2AP等多種蛋白質(zhì)組成，這些分子被稱為“足細(xì)胞相關(guān)分子”，它們有序組合，在足突間構(gòu)成拉鏈樣結(jié)構(gòu)，對蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成選擇性濾過屏障。DN時，足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白表達(dá)的改變，將導(dǎo)致腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能的異常，從而促使尿蛋白形成和/或腎小球硬化。nephrin是最早被發(fā)現(xiàn)的一種裂孔隔膜蛋白，是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵裂孔隔膜分子，相對分子質(zhì)量為135×103，特異性表達(dá)在裂孔隔膜上,是裂孔隔膜蛋白復(fù)合體的主要成分[10]。nephrin mRNA及蛋白表達(dá)的降低早于其超微結(jié)構(gòu)的改變和蛋白尿的出現(xiàn)，是腎小球足細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志物[11]。1998年Kestila[12]等從先天性芬蘭型腎病綜合征(Congenital nephrotic syndrome of the Finnish type, NPHS1)患者中成功克隆出腎病綜合征l(NPHS1)基因, 采用Northern blot 及 situ hybridization 證實NPHS1表達(dá)在腎小球，并證實該基因編碼的產(chǎn)物nephrin蛋白在腎小球濾過屏障功能中起著關(guān)鍵作用[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組腎小球nephrin mRNA表達(dá)減少，糖腎寧具有減弱DM相關(guān)的nephrin mRNA表達(dá)減少的作用。纈沙坦也體現(xiàn)了降低nephrin mRNA表達(dá)的作用(P>0.05)[14]。

足細(xì)胞足突是以actin細(xì)胞骨架為基礎(chǔ)的可收縮性結(jié)構(gòu)，其可動態(tài)調(diào)節(jié)足細(xì)胞的形態(tài)和位置，從而調(diào)控腎小球濾過功能。細(xì)胞骨架主要由微絲蛋白、中間絲蛋白、微管蛋白組成，結(jié)蛋白 desmin 屬于細(xì)胞骨架的中間絲蛋白。裂孔隔膜分子之間通常形成蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，且通過接頭蛋白與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相連結(jié),裂孔隔膜分子受損時，往往可導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重構(gòu)[15]。正常情況下腎小球系膜細(xì)胞可少量表達(dá)desmin，而足細(xì)胞無明顯表達(dá),當(dāng)足細(xì)胞損傷時,細(xì)胞骨架重新排列,可大量表達(dá)desmin發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,因此desmin可作為足細(xì)胞損傷的標(biāo)志[16-17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組腎小球desmin蛋白表達(dá)明顯增加，在中藥糖腎寧干預(yù)后，DN大鼠腎小球足細(xì)胞desmin蛋白表達(dá)明顯減少，提示足細(xì)胞的損傷減輕，與光鏡觀察結(jié)果是一致的。在本實驗中纈沙坦可升高糖尿病模型大鼠腎組織nephrin表達(dá)，降低結(jié)蛋白desmin表達(dá)，具有抑制足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用，與其他實驗研究亦具有一致性[18]。

綜上所述，初步證實糖腎寧可通過上調(diào)糖尿病大鼠降低的足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin，下調(diào)異常升高的足細(xì)胞骨架蛋白desmin，減輕腎小球足細(xì)胞損傷，降低尿蛋白，保護(hù)腎功能。因白蛋白過負(fù)荷可引起足細(xì)胞損傷并導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重構(gòu)，而裂孔隔膜蛋白因與足細(xì)胞骨架蛋白相連接，因此裂孔隔膜蛋白nephrin損傷亦可導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重構(gòu)。因此糖腎寧是通過降低蛋白尿、減輕足細(xì)胞骨架重構(gòu)，還是調(diào)控裂孔隔膜蛋白nephrin減輕足細(xì)胞骨架重構(gòu)，或是對結(jié)蛋白desmin有直接調(diào)控作用，這都需要后續(xù)進(jìn)行深入的機制研究。

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(本文編輯：蒲曉田)

·論著·

作者單位：110847 沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院(王麗)；大連市第二人民醫(yī)院消化科(李翌萌)

Effects ofTangshenningon nephrin, desmin expression of renal tissue in STZ-Induced diabetic ratsZOUDa-wei，GAOYan-bin,LiJiao-yang,etal.SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

【Abstract】ObjectiveObjective To investigate the effects of Tangshenning on podocyte injury of renal tissue in streptozotocin (STZ) induced diabetic rats. Methods: Non-diabetic rats (n=10) were designed as the control group, other rats were given STZ to induce diabetic model. The diabetic rats (fasting blood glucose≥16.7mmol /L)were randomly divided into three groups: the model group(n=12), the Tangshenning group (n=11) and the Valsartan group(n=11), After intervention with Tangshenning and valsartan for 12 weeks, 24h Urinary protein excretion (24h UPro), fasting blood glucose (FBG), serum creatinine (Scr), serum urea nitrogen(BUN) were examined. The protein and mRNA expression of podocyte slit diaphragm protein nephrin and cytoskeletal protein desmin mRNA expression were accessed. Results FBG, BUN, SCr, 24h UPro as well as desmin protein and mRNA expression of renal tissue in model group were increased significantly(P<0.05), nephrin mRNA expression of renal tissue in model group were decreased significantly (P<0.05) compared with non-diabetic rats group. Obviously, after Tangshenning or Valsartan intervention, 24h UPro, BUN and SCr were significantly declined(P<0.05), while no significant change of FBG after intervention (P>0.05).Tangshenning or valsartan could also decrease desmin expression and increase nephrin expression compared with model group. Conclusion Tangshenning could alleviate podocyte injury of renal tissue in STZ-induced diabetic rats, as well as reducing proteinuria and protecting renal function.

【Key words】Diabetic nephropathy;Tangshenning;Podocyte injury

作者簡介:王麗(1978- )，女，博士，講師。研究方向：中醫(yī)消化病基礎(chǔ)及臨床研究。E-mail :wltcm@126.com

(收稿日期：2014-08-07)

Corresponding author:GAO Yan-bin,E-mail：dfyynfm@163.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.011