射干麻黃湯對哮喘患者T細(xì)胞功能的影響

楊碩 羅光偉 胡小萍 萬軍 夏倩 陳菁 袁文勝 孫潔民

對以往未經(jīng)規(guī)范治療的初診哮喘患者，推薦按需使用短效β2受體激動(dòng)劑，并選用低劑量吸入糖皮質(zhì)激素或白三烯調(diào)節(jié)劑［1］。但部分患者尤其是輕癥患者，往往因經(jīng)濟(jì)收入和顧慮激素副作用，不愿意選用控制藥物。中西醫(yī)結(jié)合治療依從性更好，對這些患者病情控制可能是有益的。目前認(rèn)為支氣管哮喘的發(fā)病與輔助性T細(xì)胞(T helper cells，Th)亞群功能失衡、Th2活化亢進(jìn)為特征的免疫學(xué)異常相關(guān)，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-5、IL-10等 Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)異常［2］。射干麻黃湯作為哮證治療的要方，具有較好療效。麻黃湯是治療哮喘寒證的經(jīng)典方劑，在對難治性哮喘也具有良好的療效，可有效改善患者肺功能［3］，本研究探討射干麻黃湯治療對輕癥哮喘患者T細(xì)胞亞群及IL-5、IL-10表達(dá)的影響。

1 對象與方法

1.1 對象

51例研究對象來自2010年9月至2013年3月武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸科門診，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為治療組25例和對照組26例。治療組中男12例，女13例;年齡19～60歲，平均年齡(44.0±11.8)歲;對照組中男13例，女13例;年齡20～58歲，平均年齡(44.1±9.8)歲。兩組患者性別、年齡、病情嚴(yán)重程度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)［1］制定:符合哮喘防治指南中哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn);中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［4］制定，癥見氣喘，胸膈滿悶如塞，咳不甚，痰少咯吐不爽，色白而多泡沫，形寒怕冷，天冷或受寒所發(fā)，舌苔白滑，辨為冷哮者。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

年齡在18歲以上，病情為輕度發(fā)作，尚未吸入糖皮質(zhì)激素治療;中醫(yī)辨證屬于寒哮，能接受并完成治療、觀察和各項(xiàng)檢查;所有患者入試前獲得知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

合并支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等基礎(chǔ)肺病者;有嚴(yán)重心、腦、肝、腎等疾病者;誘發(fā)加重或使哮喘難以控制的因素;有重度哮喘發(fā)作史;對本試驗(yàn)藥物過敏者;妊娠和哺乳期婦女;不能依從研究方案者。

1.5 治療方法

對照組:應(yīng)用沙丁胺醇?xì)忪F劑(英國葛蘭素史克制藥有限公司，生產(chǎn)批號KR0354)100 μg，每天4次。

治療組:在對照組的基礎(chǔ)上加用射干麻黃湯，予中藥配方顆粒(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司生產(chǎn))口服，組成:射干12 g(2袋)，麻黃12 g(2袋)，細(xì)辛3 g(1袋)，生姜9 g(3袋)，大棗10 g(1袋)，紫菀12 g(2袋)，款冬花10 g(1袋)，五味子6 g(1袋)，法夏12 g(2袋)，每天1劑，早晚2次溫服。兩組均治療12周。

1.6 觀察指標(biāo)和方法

對每位患者于治療前后抽取外周靜脈血8 mL，5 mL采用全血直標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群，分析 CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分率，并計(jì)算CD4/CD8比值。另3 mL肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。將外周血單個(gè)核細(xì)胞(1×107個(gè))用經(jīng)焦碳酸二乙酯處理過的PBS液洗滌3次后移至1.5 mL的Eppendorf管中，4℃離心棄上清，用Tripure 1 mL提取總RNA，紫外線分光光度計(jì)測定其純度和含量。引物由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所合成。應(yīng)用OneStep RTPCR試劑盒(美國QIAGEN公司)，擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)參數(shù)為:50℃ 30分鐘;95℃ 15分鐘，1個(gè)循環(huán);94℃ 1 分鐘;57℃(IL-5)、62℃(IL-10)或 65℃(β-actin)1分鐘;72℃ 1分鐘，32個(gè)循環(huán);72℃延伸10分鐘。

表1 RT-PCR檢測用引物

凝膠掃描擴(kuò)增合成的RT-PCR產(chǎn)物，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)中掃描打印，并分析測定電泳帶灰度，以特異的擴(kuò)增條帶灰度與擴(kuò)增的β-actin條帶灰度之比表示目的基因相對表達(dá)水平。

1.7 療效判定

參照文獻(xiàn)［1］制定，分為完全控制、部分控制及未控制。(1)白天癥狀＞2次/周;(2)有活動(dòng)受限;(3)有夜間癥狀/憋醒;(4)需要使用緩解藥的增加次數(shù)＞2次/周;(5)1秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)＜預(yù)計(jì)值的80%。若5項(xiàng)均無為完全控制，1～2項(xiàng)為部分控制，3項(xiàng)及以上為未控制。未控制者退出試驗(yàn)升級哮喘治療。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)。兩組患者臨床療效比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后的比較用配對樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者療效比較

共5例患者試驗(yàn)期間癥狀加重并調(diào)整治療方案，其中治療組1例，對照組4例，其余患者均完成試驗(yàn)，兩組患者臨床療效比較采用秩和檢驗(yàn)，治療組療效優(yōu)于對照組(P=0.028)，詳見表2。

表2 治療組與對照組療效比較

2.2 兩組患者治療前后外周血T細(xì)胞亞群比較

兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，治療前兩組CD3+、CD4+、CD8+及 CD4/CD8 比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后兩組比較:CD3+(t=0.747，P=0.459)、CD4+(t=1.806，P=0.077)、CD8+(t=1.584，P=0.120)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD4/CD8比值明顯下降(t=2.593，P=0.012)。本組治療前后的比較用配對樣本t檢驗(yàn)，與治療前比較，對照組 CD3+、CD4+、CD8+及 CD4/CD8比值均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療組 CD3+、CD4+無明顯變化，CD8+增加(t=2.752，P=0.008)、CD4/CD8 比值下降(t=3.539，P=0.001)有統(tǒng)計(jì)意義，詳見表3。

表3 各組治療前后CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的比較(±s)

表3 各組治療前后CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的比較(±s)

注:與本組治療前比較，aP＜0.05;與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05。

組別 CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4/CD8治療組治療前 68.6±8.0 45.0±7.9 22.3±4.1 2.08±0.49治療后 67.7±7.8 40.9±7.3 25.6±4.3a1.64±0.38ab對照組治療前 70.9±7.9 46.2±7.8 22.8±4.2 2.10±0.53治療后69.4±8.6 44.5±6.7 23.7±4.1 1.92±0.38

2.3 兩組患者治療前后IL-5、IL-10表達(dá)水平比較

兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，治療前兩組IL-5、IL-10 mRNA相對表達(dá)水平無明顯差異，治療后治療組較對照組IL-5(t=2.492，P=0.016)表 達(dá) 下 降，IL-10(t=2.659，P=0.011)表達(dá)增加。本組治療后與治療前比較用配對樣本t檢驗(yàn)，對照組 IL-5(t=4.874，P＜0.01)明顯下降，IL-10無明顯改變，治療組IL-5(t=6.946，P＜0.01)明顯下降，IL-10(t=5.052，P＜0.01)明顯升高，詳見表4。

表4 各組治療前后IL-5、IL-10表達(dá)水平比較

3 討論

哮喘的治療應(yīng)以患者的病情嚴(yán)重程度為基礎(chǔ)，根據(jù)其控制水平級別選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，也要考慮患者的實(shí)際狀況，如經(jīng)濟(jì)收入和當(dāng)?shù)氐尼t(yī)療資源等。對以往未經(jīng)規(guī)范治療的初診哮喘患者可選擇第2級治療方案，按需使用短效β2受體激動(dòng)劑，并選用低劑量吸入糖皮質(zhì)激素或白三烯調(diào)節(jié)劑。部分患者尤其是輕癥患者，往往因經(jīng)濟(jì)收入和顧慮激素不良反應(yīng)，不愿意選用指定的控制藥物，而選擇第1級治療方案，該方案按需使用短效β2受體激動(dòng)劑，未指定使用何種控制性藥物。對這些患者，密切隨訪觀察病情，及時(shí)升級治療十分必要。同時(shí)，給予其他可接受的治療，如中西醫(yī)結(jié)合治療，對患者也是有益的［5］。本研究中，與對照組比較，射干麻黃湯治療組患者病情控制水平明顯提高。

T細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答中起重要作用，T淋巴細(xì)胞亞群紊亂，輔助T細(xì)胞(CD4+)水平升高，抑制T細(xì)胞(CD8+)水平下降，CD4/CD8比值失調(diào)，可導(dǎo)致IgE升高和氣道高反應(yīng)性而誘導(dǎo)哮喘發(fā)作［6］。哮喘患者氣道阻力與CD4+T細(xì)胞及CD4/CD8比值呈顯著正相關(guān)［7］，與CD8+T呈顯著負(fù)相關(guān)，射干麻黃湯治療后CD4/CD8比例的改變，有助于改善患者肺通氣。射干麻黃湯治療后患者與治療前及對照組比較CD4+T細(xì)胞數(shù)量均有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組CD8+T細(xì)胞數(shù)量較治療前顯著增加，但與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管射干麻黃湯治療后CD4+及CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化不顯著，但CD4/CD8比例變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示對機(jī)體細(xì)胞免疫功能情況產(chǎn)生顯著的影響。

CD4+T細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子對體液免疫產(chǎn)生影響，與支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)。IL-5、IL-10均為Th2細(xì)胞因子，可抑制原始T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞及Th1細(xì)胞功能。IL-5在接觸抗原后，能促進(jìn)活化B淋巴細(xì)胞向產(chǎn)生抗體細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向嗜酸性細(xì)胞(eosinophil，EOS)增殖分化。IL-5不僅可作用于EOS前體促進(jìn)其增殖分化，維持并延長成熟EOS的生存期，引起EOS趨化和黏附，還可提高抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用和抗體誘導(dǎo)的EOS脫顆粒［8］。IL-10是重要的免疫炎癥下行調(diào)節(jié)因子，它能抑制激活的CD4+T細(xì)胞的增值，抑制Th2細(xì)胞合成IL-5等多種細(xì)胞因子及炎癥的發(fā)生和發(fā)展，促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖，構(gòu)成免疫反應(yīng)的負(fù)反饋機(jī)制［9-10］。IL-10水平的升高，有助于控制哮喘患者氣道炎癥與癥狀［11］。在本研究中射干麻黃湯治療后雖然CD4+細(xì)胞數(shù)量影響較小，但I(xiàn)L-5水平顯著下降，IL-10水平顯著升高，提示射干麻黃湯能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，控制哮喘的發(fā)生。

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(本文編輯:董歷華)