DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

李　懿,李光潤(rùn)(綜述)，陳　宏(審校)

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院腫瘤科,昆明 650032 )

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DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

李懿,李光潤(rùn)(綜述)，陳宏※(審校)

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院腫瘤科,昆明 650032 )

摘要：DNA甲基化作為一種表觀遺傳學(xué)元件，參與正常細(xì)胞的發(fā)育分化、基因組印記、X染色體失活和染色質(zhì)重構(gòu)等生命過(guò)程，在腫瘤演進(jìn)中亦發(fā)揮重要作用。為滿足不斷深入的研究需求，DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)得到了較快的發(fā)展，檢測(cè)的靈敏度和特異度不斷提高，并逐步從個(gè)別位點(diǎn)向高通量檢測(cè)發(fā)展。該文綜述了目前常用的DNA甲基化分析方法，并簡(jiǎn)要總結(jié)了其在應(yīng)用中的關(guān)鍵點(diǎn)和經(jīng)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：表觀遺傳學(xué)；DNA甲基化；檢測(cè)

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的主要形式，甲基化模式的異常促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，參與腫瘤演進(jìn)[1-2]。許多基因具有腫瘤特異性的甲基化表型[3]，一方面基因組廣泛的低甲基化引起原癌基因活化，基因組不穩(wěn)定性增加[4]；另一方面啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化，引起抑癌基因及錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)沉默，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5]。研究表明，基因組的低甲基化隨著細(xì)胞惡性度的增加而愈加明顯，是病情診斷的重要指標(biāo)[6]；此外，CpG島局部的高甲基化發(fā)生于細(xì)胞惡變之前，能在早期預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生[7]，其也能有效地預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]，在腫瘤的鑒別診斷中亦發(fā)揮重要作用[9]。因此，檢測(cè)腫瘤發(fā)生中相關(guān)基因的甲基化模式具有重要意義，現(xiàn)就近年來(lái)中外文獻(xiàn)報(bào)道的甲基化檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要的分析總結(jié)。

1酶切-Southern雜交技術(shù)

酶切-Southern雜交是早期用于甲基化研究的技術(shù)，其依賴于同裂酶(HpaⅡ和MspⅠ)識(shí)別位點(diǎn)中甲基胞嘧啶的敏感度不同，與基因組DNA共同消化后，與32P標(biāo)記的檢測(cè)基因片段的探針行Southern雜交，根據(jù)片段長(zhǎng)度分辨位點(diǎn)的甲基化情況。該方法簡(jiǎn)單且實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋，可進(jìn)行基因CpG島總體甲基化模式的定量研究，但樣品需要量大且僅提供位于甲基化敏感限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列中的CpG甲基化信息，易出現(xiàn)由不完全酶切引起的假陽(yáng)性。

2亞硫酸氫鈉修飾后測(cè)序法

亞硫酸氫鈉修飾后測(cè)序法是一種對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增與DNA測(cè)序相結(jié)合的方法，能夠提供測(cè)定區(qū)域的序列信息，準(zhǔn)確定位甲基化胞嘧啶位點(diǎn)；重亞硫酸鹽修飾后，甲基化胞嘧啶保持不變，但非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，PCR擴(kuò)增后為胸腺嘧啶，其將甲基化狀態(tài)的差異轉(zhuǎn)化成堿基的差異，從而對(duì)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析；但在亞硫酸鈉處理的酸性環(huán)境下，單鏈特異性PCR模板穩(wěn)定性下降，容易降解；并且模板鏈CG二核苷酸水平高易形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，常出現(xiàn)非特異性條帶，結(jié)合“巢式PCR法”能顯著提高擴(kuò)增的特異度[10]。在運(yùn)用亞硫酸氫鈉修飾后測(cè)序法中要注意如下5個(gè)方面。①DNA的質(zhì)量控制：DNA模板純度要求高，含量約2 μg，否則在亞硫酸鹽處理時(shí)會(huì)因DNA模板太多致使DNA處理不完全進(jìn)而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗，如果DNA模板太少會(huì)導(dǎo)致假陰性。②修飾時(shí)的溫度控制：溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)導(dǎo)致DNA模板處理失敗，所用試劑一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，保證試劑的pH值為8.0，否則會(huì)降低修飾效率，修飾后的模板應(yīng)保存在-20 ℃，不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月。③引物的合理設(shè)計(jì)：在亞硫酸氫鈉修飾后測(cè)序法中引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循如下原則：a.主要針對(duì)編碼鏈設(shè)計(jì)引物，以修飾后的DNA序列作為模板；b.選擇CpG島作為PCR擴(kuò)增的靶區(qū)域；c.引物根據(jù)不含CpG位點(diǎn)的序列來(lái)設(shè)計(jì),但擴(kuò)增區(qū)域中應(yīng)包括盡可能多的CpG位點(diǎn)。④退火溫度的控制：在PCR反應(yīng)中，CG含量高的退火溫度值高，非甲基化引物中正義引物不含C，反義引物不含G。⑤反應(yīng)增強(qiáng)劑：當(dāng)CG含量高于70%或模板中有二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)可考慮添加增強(qiáng)劑，從而減低G+C富集區(qū)的熔點(diǎn)及解鏈溫度、提高擴(kuò)增效率，并增加Taq DNA連接酶的穩(wěn)定性，防止其因溫度升高而變性。但一定要注意它們的濃度范圍(二甲基亞砜 1%～10%，甘油5%～20%)，超過(guò)一定濃度對(duì)酶有抑制作用，反而使擴(kuò)增效率降低。

3甲基化特異性PCR

MS-PCR以亞硫酸鈉修飾的甲基化依賴的單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)能區(qū)分基因組甲基化狀態(tài)的引物，識(shí)別亞硫酸鈉修飾的甲基化和非甲基化等位基因的序列差異，同時(shí)也識(shí)別沒(méi)有修飾DNA和不完全修飾DNA的序列差異，通常選擇胞嘧啶含量高的序列設(shè)計(jì)引物，引物的3′端鄰近檢測(cè)的CpG二核苷酸，引物覆蓋序列中CpG島所占比例越高，甲基化DNA檢出率越高。該方法簡(jiǎn)單、省時(shí)、敏感，還可用于石蠟包埋樣品甲基化分析，能檢測(cè)出樣品中0.1%的甲基化DNA含量[11]。為提高甲基化的檢出率，對(duì)甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)進(jìn)行改進(jìn)后設(shè)計(jì)出半巢式PCR和巢式PCR。其中，半巢式PCR是指用甲基化引物MS、M2A和非甲基化引物US、U2A分別進(jìn)行甲基化和非甲基化的特異性擴(kuò)增；然后在MS和M2A之間增加一條引物M1A，再以MS、M1A進(jìn)行第二輪甲基化特異性擴(kuò)增，同樣的用US、U1A作第二輪的非甲基化擴(kuò)增。而巢式PCR是指用非特異性的外側(cè)引物對(duì)處理后的樣品進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用特異性的內(nèi)側(cè)甲基化引物和非甲基化引物做第二輪擴(kuò)增。用MS-PCR擴(kuò)增后，可能會(huì)出現(xiàn)如下3種可能的結(jié)果：①產(chǎn)物電泳為陰性(無(wú)目的基因帶出現(xiàn))；②產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多條非特異帶(包括目的基因)；③產(chǎn)物電泳為陽(yáng)性(只有目的基因帶)。出現(xiàn)①和②結(jié)果時(shí)，在保證反應(yīng)體系和引物沒(méi)有問(wèn)題的情況下可通過(guò)調(diào)整MS-PCR的反應(yīng)溫度而得到目的基因帶。按圖1所示的方法，根據(jù)電泳結(jié)果調(diào)整退火溫度[12]。

a:產(chǎn)物電泳為陰性(無(wú)目的基因帶出現(xiàn))；b:擴(kuò)增出特異的目的條帶；c:產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多條非特異帶(包括目的基因)；當(dāng)出現(xiàn)a和c的情況時(shí)，按圖中所示調(diào)整退火溫度；↑表示升高退火溫度；↓表示降低退火溫度圖1　甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)電泳結(jié)果

4結(jié)合亞硫酸鹽處理的限制酶解分析法

該技術(shù)通過(guò)限制性酶切反應(yīng)揭示亞硫酸鈉處理、PCR擴(kuò)增后引入的甲基化依賴的單核苷酸多態(tài)性。Xiong和Laird[13]闡述了結(jié)合亞硫酸鹽處理的限制酶解分析法的基本步驟，用限制性內(nèi)切酶BstUI識(shí)別2個(gè)CG二核苷酸均發(fā)生甲基化的序列(5mCG5mCG)，用限制性內(nèi)切酶TaqI僅識(shí)別1個(gè)CG二核苷酸的甲基化，進(jìn)行限制性切割后，能準(zhǔn)確定量樣本的甲基化比例。該方法操作簡(jiǎn)單，能準(zhǔn)確定量，可分析微切割的石蠟包埋樣品，避免了Southern雜交定量時(shí)由甲基敏感性酶產(chǎn)生的假陽(yáng)性；但其局限性在于只能獲得特殊酶切位點(diǎn)的甲基化情況，不能除外假陰性檢測(cè)的可能性。用亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法進(jìn)行甲基化檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意：①引物的設(shè)計(jì)與MS-PCR不同，亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法的引物不能含有CpG雙核苷酸序列；而MS-PCR要有分別針對(duì)甲基化和非甲基化的引物，引物中保證有3個(gè)以上的CpG雙核苷酸序列。②亞硫酸鈉處理的質(zhì)量要求高，可通過(guò)設(shè)立限制性內(nèi)切酶Hsp9211酶切內(nèi)對(duì)照確保亞硫酸鈉修飾完全。③所有的酶切反應(yīng)在適宜溫度下至少進(jìn)行4 h[14]。

5差異甲基化位點(diǎn)掃描

該方法利用低熔點(diǎn)瓊脂糖對(duì)基因組DNA的保護(hù)作用，使DNA免受物理性損傷，避免DNA分散，使得從少量的細(xì)胞(10個(gè)細(xì)胞/反應(yīng))中既可獲取大量DNA進(jìn)行甲基化檢測(cè)，同時(shí)在瓊脂糖中進(jìn)行限制性酶切后，用重復(fù)序列引物或隨機(jī)引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，利用甲基化和非甲基化模板擴(kuò)增產(chǎn)物的片段差異，進(jìn)行第二輪任意引物的擴(kuò)增，根據(jù)變性電泳后擴(kuò)增條帶的亮度反映模板的甲基化程度[15]。該方法對(duì)樣品的需要量非常少，能有效地避免大量樣品間由于細(xì)胞異質(zhì)性引起的差異，結(jié)果可信度高，其使單細(xì)胞甲基化分析成為可能。

6甲基化熒光檢測(cè)法

該方法是在MSP技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光實(shí)時(shí)PCR的甲基化定量分析方法。經(jīng)亞硫酸鈉處理后，需要用雙標(biāo)記的熒光探針進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)探針與靶序列完全匹配時(shí)，可被具有核酸外切酶活性的Taq DNA多聚酶切割，釋放5′端報(bào)告基因，遠(yuǎn)離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，使得5′端熒光染料受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)可被探頭檢測(cè)，熒光信號(hào)的大小與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成比例[16]。其中，鎖式探針作為近來(lái)常用的一種探針形式，其原理是在完全匹配的前提下，線性鎖式探針被有效地連接成環(huán)形，并可以在后續(xù)的PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增；而沒(méi)有配對(duì)的序列時(shí)，探針只能以線性的形式存在，在核酸外切酶作用下，線性探針被消化水解而不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。該方法避免了上述檢測(cè)技術(shù)中PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳及限制性酶切的常規(guī)操作，在一定程度上提高了檢測(cè)的敏感度及特異度，常用于臨床標(biāo)本的分析。但由于檢測(cè)探針的價(jià)格較高，且需要依賴昂貴的定量PCR儀，所以檢測(cè)的成本較高。

7甲基化特異性寡核苷酸微陣列

依據(jù)基因組范圍內(nèi)分析基因突變和單核苷酸多肽性的微陣列雜交技術(shù)原理，發(fā)展了甲基化特異性寡核苷酸微陣列，利用模板中甲基化狀態(tài)的差異經(jīng)PCR反應(yīng)后擴(kuò)增出不同的核苷酸序列，與微陣列上的能區(qū)分特異胞嘧啶位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的寡核苷酸探針雜交，高通量同步定量分析全基因組的甲基化模式[18]。Gitan等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，部分甲基化特異性核寡苷酸微陣列檢測(cè)為0甲基化的樣品能被MSP的甲基化引物擴(kuò)增出了一條微弱的條帶，提示雜交背景的信號(hào)影響了其對(duì)CpG島低甲基化水平的檢測(cè)，可通過(guò)調(diào)整雜交條件和洗片條件來(lái)減少假陽(yáng)性結(jié)果。此方法的關(guān)鍵是寡核苷酸探針，設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意：①針對(duì)2個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)的探針，能顯著減少交叉反應(yīng)，但應(yīng)避免連續(xù)超過(guò)4個(gè)胸腺嘧啶殘基或鳥(niǎo)嘌呤殘基；②重疊2個(gè)以上的CpG位點(diǎn)，則探針應(yīng)包括每個(gè)位點(diǎn)甲基化和非甲基化胞嘧啶的所有組合；③實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)立明確的對(duì)照系統(tǒng)測(cè)試寡核苷酸探針的有效性。該方法能形成癌癥遺傳圖譜，具有良好的應(yīng)用前景[20]。

8變性高效液相層析

將亞硫酸鈉修飾后的DNA分解為單核苷酸后，依據(jù)5種核苷酸在極性溶液中的溶解度不同，其在色譜柱中的保留時(shí)間存在差異，溶解度高的隨極性溶液先過(guò)濾出，而溶解度低的則在柱中的停留時(shí)間較長(zhǎng)，各核苷酸的出柱順序是：dCp、5′mdCp、Tp、dGp和dAp,從而了解樣品全基因組水平的甲基化程度，但該方法的局限性在于不能了解特定基因的甲基化的位置和狀態(tài)，并且對(duì)樣品DNA的純度要求高，不能有RNA的污染[21]。

9甲基化DNA免疫共沉淀

利用5-甲基胞嘧啶特異性抗體或含有甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，通過(guò)免疫沉淀作用于特異性的富集基因組中的甲基化或非甲基化片段。其基本程序是：將基因組DNA打斷為400～500 bp的片段，經(jīng)加熱變性后將樣品分為2份，其中1份作為T(mén)otal input DNA 樣品，而另1份加入甲基化DNA特異性抗體，使用親和層析分離上述樣品中的甲基化DNA片段抗體復(fù)合物，而洗脫其中的非甲基化片段，純化得到的甲基化DNA可以結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)或芯片技術(shù)檢測(cè)基因的甲基化[22]。該方法特異度高，精確性好，避免了探針合成，但是對(duì)低CpG密度區(qū)域的甲基化分析存在問(wèn)題。

10結(jié)語(yǔ)

甲基化檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，為揭示疾病中基因表達(dá)沉默的表觀遺傳機(jī)制提供了有效的手段，從而能夠高通量地分析多個(gè)基因多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化模式，并從總體動(dòng)態(tài)的角度了解疾病相關(guān)的甲基化信息。通過(guò)介紹近幾年來(lái)DNA甲基化檢測(cè)的新方法，總結(jié)了各方法在應(yīng)用中的經(jīng)驗(yàn)和注意事項(xiàng)希望能對(duì)DNA甲基化的研究者有所幫助。同時(shí)也期待著甲基化技術(shù)的不斷進(jìn)步，檢測(cè)的敏感度和特異度不斷提高，以滿足臨床檢測(cè)的要求，使其臨床的應(yīng)用范圍更加廣泛，能更好地指導(dǎo)臨床的個(gè)體化診療。

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Progresses and Experiences of DNA Methylation Detection TechniquesLIYi,LIGuang-run,CHENHong.(DepartmentofOncology,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Kunming650032,China)

Abstract:DNA methylation,as an epigenetic component,is involved in the processes of cell development,differentiation,genomic imprinting,X chromosome inactivation and chromatin remodeling,and plays an important role in carcinogenesis as well.The DNA methylation analysis technology has been developing rapidly due to the needs of deeper research:analyses that previously were restricted to specific loci can now be performed on a high throughput,meanwhile the sensitivity and specificity have made great of improvements as well.Here is to make a review of the methods to detect DNA methylation and summarize the key points and experiences in application.

Key words:Epigenetic; DNA methylation; Detection

收稿日期：2014-02-27修回日期：2014-06-23編輯：鄭雪

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81201756)；云南省自然科學(xué)基金(2012FD091)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.02.005

中圖分類號(hào)：Q3-3； Q751

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)02-0204-04