缺氧誘導因子2α在肝癌中的表達及其與血管生成、上皮間質轉化的關系

姚啟楊，潘婷婷，許戈良，李建生，馬金良，莢衛(wèi)東，余繼海，葛勇勝，劉文斌，任維華

缺氧誘導因子2α在肝癌中的表達及其與血管生成、上皮間質轉化的關系

姚啟楊1，潘婷婷2，許戈良1，李建生1，馬金良1，莢衛(wèi)東1，余繼海1，葛勇勝1，劉文斌1，任維華1

摘要目的 研究缺氧誘導因子2α（HIF-2α）在肝細胞肝癌中的表達情況及其與血管生成和上皮間質轉化（EMT）的關系。方法 收集正常肝組織15例、肝癌組織和相應的癌旁組織各63例，采用免疫組化染色法檢測HIF-2α的表達，分析其表達與肝癌臨床病理特征及生存預后之間的關系；同時分析肝癌組織中HIF-2α、白細胞分化抗原34（CD34）、波形蛋白（Vimentin）的表達，探究HIF-2α的表達與血管生成、EMT的關系。結果 免疫組化染色法顯示HIF-2α在肝癌組織中主要在胞質表達，顯著高于癌旁組織及正常肝組織（P＜0.001）。HIF-2α的表達與腫瘤最大徑、腫瘤TNM分期、Edmondson分級及包膜和血管侵犯有關，與患者年齡、性別、乙肝表面抗原表達、甲胎蛋白（AFP）、Child-Pugh分級、腫瘤結節(jié)數(shù)目及腫瘤內壞死無關。相關性分析顯示HIF-2α的表達與微血管密度（MVD）有關（t＝5.919，P＜0.001），與Vimentin的表達無關（r＝1.013，P＝0.209）。生存分析顯示，高表達組術后總體生存率明顯低于低表達組（P＜0.001）。多因素分析顯示瘤內壞死、腫瘤血管侵襲和HIF-2α表達是影響肝癌患者總生存率的獨立危險因素。結論HIF-2α可促進肝癌血管生成，但可能不參與EMT，可作為判斷肝癌患者預后的指標之一。

關鍵詞肝癌；缺氧誘導因子2α；血管生成，病理性；因素分析，統(tǒng)計學

2015－01－22接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院普通外科、肝膽胰外科安徽省重點實驗室，合肥 230001

2天津醫(yī)科大學附屬研究生學院，天津 300070

缺氧誘導因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）也稱為內皮PAS區(qū)域蛋白1，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其參與能量代謝、血管生長、侵襲轉移等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［1］。該實驗采用免疫組化SP法檢驗HIF-2α的表達是否對肝細胞肝癌的血管生成和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）產(chǎn)生影響，探討HIF-2α與肝癌的發(fā)生發(fā)展及預后的關系。

1 材料與方法

1．1 病例資料 收集2008年10月～2012年7月于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院行根治性手術切除且術后病理證實為肝細胞性肝癌患者的組織標本，肝癌組織和對應的癌旁組織各63例；其中男50例，女性13例，年齡31～74（54.9±11.5）歲?；颊咝g前均未接受過介入、化療等抗腫瘤治療，術后未出現(xiàn)如大出血、膽漏、肝功能衰竭等嚴重并發(fā)癥。其中Edmondson分級Ⅰ級14例，Ⅱ級34例，Ⅲ-Ⅳ級15例；臨床TNM分期Ⅰ-Ⅱ期25例，Ⅲ-Ⅳ期38例。另取15例非腫瘤原因行肝部分切除術的肝臟組織作為對照，鏡下證實為正常肝組織。

1．2 試劑 鼠抗人HIF-2α抗體購自美國Abcam公司；鼠抗白細胞分化抗原34（CD34）、波形蛋白（Vimentin）抗體、辣根過氧化物酶標記的通用型二抗和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1．3 免疫組化染色法 標本常規(guī)行石蠟切片，切片厚度4 μm；每張切片先行HE染色，再按照試劑盒說明書進行SP法染色。陰性對照以PBS液代替一抗。結果判定：Vimentin和HIF-2α蛋白以細胞質中出現(xiàn)黃色顆粒視為陽性表達。染色判定采用半定量計數(shù)法，即低倍鏡（10×10）視野下檢測染色強度（0 ～3分依次為無、弱、中、強），高倍鏡（40×10）下隨機選取10處視野根據(jù)肝癌陽性細胞比例即＜5%、5%～25%、26%～50%、＞50%依次評為0、1、2、3分；將兩項得分相乘即為最后得分，＜4分為低表達，≥4為高表達；將HIF-2α染色判定得分＜4分者納入HIF-2α低表達組，≥4分者納入HIF-2α高表達組。CD34染色以血管內皮細胞的細胞膜或細胞質出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性，以腫瘤內微血管密度（micro vessel density，MVD）的大小來判斷新生血管表達情況［2］：低倍鏡（10×10）下選擇血管分布最密區(qū)，高倍鏡（10×20）下選取5個視野計數(shù)染色的血管數(shù)目，計算平均值即為MVD，其中血管直徑較大或血管壁厚者不計數(shù)。

1．4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16．0軟件進行分析。

率的比較采用χ2檢驗和Person相關性分析，均數(shù)的比較采用t檢驗。累積生存率采用Kaplan-Meier法，單因素分析預后采用Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型，比較相對危險度（relative risk，RR）和95%CI。

2 結果

2．1 肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中HIF-2α的表達 免疫組化染色法顯示HIF-2α主要在肝癌細胞的胞質中表達。見圖1。在肝癌組織中高表達率為74.6%（47／63），顯著高于癌旁組織（30.2%，19／63）及正常肝組織（13.3%，2／15）（χ2＝24.945、19.473，P＜0.001）。HIF-2α的高表達與肝癌患者臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，HIF-2α的高表達與腫瘤最大徑（χ2＝4.826，P＝0.028）、TNM分期（χ2＝4.665，P＝0.031）、Edmondson分級（χ2＝6.537，P ＝0.038），包膜侵犯（χ2＝6.932，P＝0.008）及血管侵犯（χ2＝4.701，P＝0.030）有關，而與患者年齡、性別、乙肝表面抗原表達、甲胎蛋白（a-fetopretein，AFP）、Child-Pugh分級、腫瘤結節(jié)數(shù)目及腫瘤內壞死無關。見表1。

表1　HIF-2α的表達與肝癌臨床病理特征的相關性

2．2 肝癌組織中HIF-2α表達與CD34、Vimentin的表達的相關性 CD34主要在腫瘤血管內皮細胞中表達。見圖1。免疫組化染色法顯示，HIF-2α高表達組的肝癌組織中MVD（60.850±20.381）明顯高于低表達組的MVD（35.240±18.598），差異有統(tǒng)計學意義（t＝5.919，P＜0.001），說明腫瘤壞死周邊HIF-2α高表達。Vimentin主要在肝癌細胞的胞質中表達，呈棕黃色顆粒，其在肝癌組織中高表達率69.8%（44／63），HIF-2α的表達與Vimentin的表達無相關性（r＝1.013，P＝0.209）。見圖1。

2．3 HIF-2α表達與患者總體生存率的關系 入組病例均有完整的隨訪資料，隨訪時間2～62個月，中位隨訪時間為21.2個月。HIF-2α高表達組1年、3年累積生存率分別為53.2%和10.6%，相對低表達組為87.5%和37.5%。Log-rank檢驗分析表明HIF-2α高表達組比低表達組預后更差（χ2＝15.686，P＜0.001），見圖2。Cox回歸模型顯示TNM分期、包膜侵犯、腫瘤最大徑及病理分級不是影響患者術后總體生存率的獨立因素；瘤內壞死（RR＝1.851，95%CI：1.168～2.933，P＝0.009）、腫瘤血管侵襲（RR＝1.929，95%CI：1.173～3.171，P ＝0.010）和HIF-2α表達（RR＝3.964，95%CI：2.235～7.028，P＜0.001）是影響肝癌患者總生存率的獨立危險因素。見表2。

表2　多因素分析影響肝細胞肝癌患者預后的因素（Cox回歸模型）

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，在常見惡性腫瘤發(fā)生率中位居第五位，其發(fā)生率在逐年上升［3］。目前認為外科手術切除是治療肝癌的首選和最有效的方法，但遠期療效不佳，術后5年生存率僅為34.8%［4］。腫瘤的侵襲轉移和復發(fā)是影響肝癌患者生存的主要因素，探究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制對改善患者預后和提高患者生存率有十分重要的意義。

HIF-2α是bHLH-PAS超家族成員之一，可介導調節(jié)下游多種基因，進而促進腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤細胞增殖、參與EMT過程及調節(jié)腫瘤干細胞生物學特性［5］。在結腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、惡性膠質瘤等［6］多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)HIF-2α的表達顯著升高，但其在肝癌組織的表達國內外研究不一，Yang et al［7］認為HIF-2α的高表達是肝癌預后不良的一個獨立危險因素，但與臨床病理關系并不密切；Sun et al［8］認為HIF-2α的高表達有抑制肝癌生長的作用。因此需要多中心、多樣本的研究來排除實驗的假陽性和假陰性。

本實驗免疫組化染色法顯示HIF-2α在肝癌中表達明顯高于癌旁組織和正常組織。臨床病理分析顯示HIF-2α高表達和腫瘤的增殖、侵襲轉移有關，與研究［9］結果相似。HIF-2α在肝癌組織中表達上調可能與肝癌組織慢性缺血低氧及抑癌基因VHL的失活有關。

相關性研究表明肝癌組織中HIF-2α的表達與MVD相關，提示HIF-2α的表達與肝癌新血管的生成呈正相關性。新生血管的生成過程包括細胞外基質降解，內皮細胞遷移、增殖和管腔形成，而新生血管生成不僅僅與腫瘤供氧有關，與腫瘤的侵襲轉移也密切相關。目前認為HIF-2α促腫瘤血管生成可能機制包括［10-13］：①調控血管內皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，同時可增強內皮細胞中VEGF受體轉錄，促進VEGF與受體結合，參與血管的生成；②調控VEGF外的血管生成因子的表達，如IL-8和CD82，前者參與腫瘤的血管生成及腫瘤生長轉移，后者可降低腫瘤細胞的運動活性，增加內皮細胞遷徙能力促進血管生成；此外HIF-2α可調控低氧誘導促有絲分裂因子表達，后者本身除了有強縮血管作用外，還可促進血管生成和血管增生；③調控VEGF受體外的血管生成因子受體的表達如促進血管生成素受體2的表達。

EMT過程在肝癌的轉移過程中有重要的作用，低氧環(huán)境可誘導肝癌發(fā)生EMT過程，體外實驗［6，14］表明HIF-2α可調控Snail、twist、Nanog、Oct3／4等基因進而參與EMT過程，但本實驗顯示在肝癌中HIF-2α的表達與Vimentin的表達并無相關性，提示在肝癌中HIF-2α的表達與EMT過程之間的關系并不顯著，可能由于EMT本身是腫瘤發(fā)展的一個瞬時過程，而免疫組化染色也是一種“快照”技術，有捕捉不到的可能性，因此進一步的研究是必要的。

此外，生存分析顯示低表達HIF-2α的患者術后累積生存率明顯優(yōu)于高表達的患者，多因素分析顯

示HIF-2α高表達是影響肝癌術后生存的獨立危險因素。綜上所述，HIF-2α蛋白表達在肝癌組織和正常肝組織中差異有統(tǒng)計學意義，HIF-2α與肝癌促血管生成和侵襲轉移的發(fā)生有關，同時HIF-2α可作為判斷肝癌患者預后的有效生物學指標，可能為肝癌的治療提供新的有潛力的靶點。

參考文獻

［1］ Tian H，McKnight S L，Russell D W．Endothelial PAS domain protein 1（EPAS1），a transcription factor selectively expressed in endothelial cells［J］．Genes Dev，1997，11（1）：72－82．

［2］ Weidner N，Semple J P，Welch W R，et al．Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma［J］．N Engl J Med，1991，324（1）：1－8．

［3］ Güthle M，Dollinger M M．Radiologe［J］．Radiologe，2014，54（7）：654－9．

［4］ Fan S T，Mau Lo C，Poon R T，et al．Continuous improvement of survival outcomes of resection of hepatocellular carcinoma：a 20-year experience［J］．Ann Surg，2011，253（4）：745－58．

［5］ Li Z，Bao S，Wu Q，et al．Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells［J］．Cancer Cell，2009，15 （6）：501－13．

［6］ Keith B，Johnson R S，Simon M C．HIF1α and HIF2α：sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression［J］．Nat Rev Cancer，2011，12（1）：9－22．

［7］ Yang S L，Liu L P，Jiang J X，et al．The correlation of expression levels of HIF-1α and HIF-2α in hepatocellular carcinoma with capsular invasion，portal vein tumor thrombi and patients′clinical outcome［J］．Jpn J Clin Oncol，2014，44（2）：159－67．

［8］ Sun H X，Xu Y，Yang X R，et al．Hypoxia inducible factor 2 alpha inhibits hepatocellular carcinoma growth through the transcription factor dimerization partner 3／E2F transcription factor 1-dependent apoptotic pathway［J］．Hepatology，2013，57（3）：1088－97．

［9］ Bangoura G，Liu Z S，Qian Q，et al．Prognostic significance of HIF-2alpha／EPAS1 expression in hepatocellular carcinoma［J］．World J Gastroenterol，2007，13（23）：3176－82．

［10］Ku J H，Park Y H，Myung J K，et al．Expression of hypoxia inducible factor-1α and 2α in conventional renal cell carcinoma with or without sarcomatoid differentiation［J］．Urol Oncol，2011，29（6）：731－7．

［11］Florczyk U，Czauderna S，Stachurska A，et al．Opposite effects of HIF-1α and HIF-2α on the regulation of IL-8 expression in endothelial cells［J］．Free Radic Biol Med，2011，51（10）：1882－92．

［12］Nagao K，Oka K．HIF-2 directly activates CD82 gene expression in endothelial cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2011，407 （1）：260－5．

［13］Liang Y，Li X Y，Rebar E J，et al．Activation of vascular endothelial growth factor A transcription in tumorigenic glioblastoma cell lines by an enhancer with cell type-specific DNase I accessibility ［J］．J Biol Chem，2002，277（22）：20087－94．

［14］Mathieu J，Zhang Z，Zhou W，et al．HIF induces human embryonic stem cell markers in cancer cells［J］．Cancer Res，2011，71（13）：4640－52．

Expression of hypoxia-inducible factor-2α in hepatocellular carcinoma and its relationship with epithelial-mesenchymal transition and angiogenesis

Yao Qiyang1，Pan Tingting2，Xu Geliang1，et al
（1Anhui Province Key Laboratory of Hepatopancreatobiliary Surgery，Dept of Hepatic Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001；2Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjing 300070）

AbstractObjective To explore the expression of hypoxia-inducible factor-2α（HIF-2α）in hepatocellular carcinoma and the relationship with epithelial-mesenchymal transition（EMT）and angiogenesis．Methods The expressions of HIF-2α in 63 cases of hepatocellular carcinoma tumor tissues and 15 normal liver tissues were examined by immunohistochemistry．To assess the relationship between the expressions of HIF-2α，EMT and angiogenesis，the expressions of CD34 and Vimentin were detected in hepatocellular carcinoma．Results Immunohistochemistry showed that HIF-2α mainly expressed in the cytoplasm，the rate of HIF-2α overexpression in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than the other two groups（P＜0.001）．The expression of HIF-2α was correlated with tumor size，TNM stages，Edmondson grade，capsule or vascular invasion．HIF-2α expression had a significantly positive correlation with microvascular density（t＝5.919，P＜0.001），but not vimentin（r＝1.013，P＝0.209）．Survival analysis showed that the prognosis was poor in patients with HIF-2α overexpression（P＜0.001）．Cox regression demonstrated that the expression of HIF-2α，tumor necrosis and vascular invasion were the independent risk factors for cumulative survival in hepatocellular carcinoma patients．Conclusion HIF-2α can promote angiogenesis，but may not participate in EMT．It may be a potential tumor marker for prognosis of hepatocellular carcinoma．

Key wordscarcinoma，hepatocellular；HIF-2α；angiogenesis，pathologic；factor analysis，statistical

作者簡介：姚啟楊，男，碩士研究生；許戈良，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：xugeliang2007＠163．com

基金項目：安徽省科技計劃項目（編號：1106c0805028）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0491－04

中圖分類號R 735．7